乳歯歯髄由来ヒトｉＰＳ細胞からの歯髄幹細胞への分化誘導制御

控制乳牙牙髓来源的人 iPS 细胞分化为牙髓干细胞

• 批准号: 15J03924
• 负责人: 村上 智哉
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J03924/
• 关键词: 乳歯歯髄細胞; LEF-1; 乳歯歯髄幹細胞; piggyBacトランスポゾン

LEF-1は、生物の発生に重要なwnt/β-cateninシグナルにおける転写因子であり、β-cateninを介してwnt標的遺伝子の転写に関わることがわかっている。また、iPS細胞を含めた幹細胞における未分化の維持・増殖に関与することも報告されている。そこで、LEF-1が歯髄幹細胞を含めた未分化な歯系細胞においてマーカーとなるのではと考え本研究においてプロモーターとして採用することとした。本研究では、LEF-1プロモーターを配したプラスミドベクターとして、遺伝子導入効率が高いとされるpiggyBacトランスポゾン系を採用した。ヒトLEF-1プロモーター＋EGFP cDNA＋抗生物質耐性遺伝子（Neomycin）を挿入したプラスミドpTA-LENを作製した。pTA-LENを乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入行い、薬剤選択およびEGFP発現を指標とし、LEF-1発現細胞を取得し、幹細胞としての可能性について検討することを目的とした。これまでの研究より、pTA-LENを乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入行い薬剤選択後、LEF-1発現細胞を採取することができた。今年度は、これまでLEF-1発現細胞の神経系および骨系への分化誘導後の評価が不十分であったため、LEF-1発現細胞を分化誘導後にRT-PCR解析を行いmRNAレベルでの評価を行った。結果、代表的な神経芽細胞および骨芽細胞の分化マーカーが検出され、LEF-1発現細胞の多分化能が強く示唆された。加えて、乳歯歯髄細胞由来iPS細胞へpTA-LENを遺伝子導入行った。しかし、薬剤選択時に遺伝子組換えiPS細胞が薬剤耐性フィーダーごと剥がれてしまうことがあり、条件等を変更し培養方法等を検討してきた。薬剤耐性のLEF-1発現iPS細胞を単離することが現時点では十分に確立できておらず、培養方法等の検討を行っていく必要がある。

LEF-1是wnt/β-catenin信号中的转录因子，对生物体的发育很重要，已知通过β-catenin参与wnt靶基因的转录。据报道，它参与未分化干细胞（包括 iPS 细胞）的维持和增殖。因此，我们认为LEF-1可能作为未分化牙细胞（包括牙髓干细胞）的标记物，并决定在本研究中使用它作为启动子。在本研究中，我们使用了具有高基因转移效率的piggyBac转座子系统作为含有LEF-1启动子的质粒载体。创建了质粒pTA-LEN，其中插入了人LEF-1启动子+EGFP cDNA+抗生素抗性基因（新霉素）。本研究的目的是将pTA-LEN导入乳牙牙髓细胞，以药物选择和EGFP表达为指标，获得LEF-1表达细胞，并考察其作为干细胞的潜力。基于之前的研究，我们能够将pTA-LEN导入乳牙牙髓细胞，经过药物选择后，我们能够收集表达LEF-1的细胞。本财年，由于对诱导分化为神经系统和骨系统后的LEF-1表达细胞的评估不充分，我们在LEF-1表达细胞诱导分化后进行了RT-PCR分析，以评估mRNA我们进行了评估。结果，检测到典型的成神经细胞和成骨细胞分化标记物，强烈表明LEF-1表达细胞的多能性。此外，pTA-LEN 被转染至源自乳牙牙髓细胞的 iPS 细胞中。然而，在药物选择过程中，转基因iPS细胞有时会与耐药饲养层一起分离，因此我们一直在考虑改变条件和培养方法。目前，尚未完全确定是否可以分离表达耐药LEF-1的iPS细胞，有必要研究培养方法等。

项目成果

Choice of Feeders Is Important When First Establishing iPSCs Derived From Primarily Cultured Human Deciduous Tooth Dental Pulp Cells.

• DOI: 10.3727/215517915x689038
• 发表时间: 2015-12
• 期刊: Cell medicine
• 作者: I. Saitoh;E. Inada;Y. Iwase;H. Noguchi;Tomoya Murakami;Miki Soda;Naoko Kubota;H. Hasegawa;Eri Akasaka;Y. Matsumoto;K. Oka;Y. Yamasaki;H. Hayasaki;Masahiro Sato

Tissue-Specific Stem Cells Obtained by Reprogramming of Non-Obese Diabetic (NOD) Mouse-Derived Pancreatic Cells Confer Insulin Production in Response to Glucose.

• DOI: 10.1371/journal.pone.0163580
• 发表时间: 2016
• 期刊: PloS one
• 影响因子: 3.7
• 作者: Saitoh I;Sato M;Soda M;Inada E;Iwase Y;Murakami T;Ohshima H;Hayasaki H;Noguchi H
• 通讯作者: Noguchi H

PiggyBac transposon-mediated gene delivery efficiently generates stable transfectants derived from cultured primary human deciduous tooth dental pulp cells (HDDPCs) and HDDPC-derived iPS cells.

• DOI: 10.1038/ijos.2015.18
• 发表时间: 2015-09-14
• 期刊: International journal of oral science
• 影响因子: 14.9
• 作者: Inada E;Saitoh I;Watanabe S;Aoki R;Miura H;Ohtsuka M;Murakami T;Sawami T;Yamasaki Y;Sato M
• 通讯作者: Sato M

Isolation and characterization of lymphoid enhancer factor-1-positive deciduous dental pulp stem-like cells after transfection with a piggyBac vector containing LEF1 promoter-driven selection markers.

• DOI: 10.1016/j.archoralbio.2017.04.033
• 发表时间: 2017-09
• 期刊: Archives of oral biology
• 影响因子: 3
• 作者: Tomoya Murakami;I. Saitoh;Masahiro Sato;E. Inada;Miki Soda;M. Oda;H. Domon;Y. Iwase;T. Sawami;Kazunari Matsueda;Y. Terao;H. Ohshima;H. Noguchi;H. Hayasaki

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