マイクロRNAの強制発現によるヒト歯系幹細胞の単離とそのインスリン分泌誘導性

通过强制表达 microRNA 分离人牙齿干细胞及其胰岛素分泌诱导能力

• 批准号: 22K17081
• 负责人: 村上 智哉
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Asahi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K17081/
• 关键词: iPS細胞; 乳歯歯髄細胞; マイクロRNA; mirPS細胞; インスリン分泌細胞; 抗腫瘍性; 高効率な初期化; 乳歯; miRNA; iTS細胞

iPS細胞は再生研究において活発な研究が行われている。その作製にあたっては山中因子と呼ばれる４種の初期化遺伝子の遺伝子導入が必要であるが、その遺伝子導入効率は高くなく、また腫瘍形成のリスクが残存している。これらの問題を解決すべく、近年ではマイクロRNA(miRNA)を使用したiPS細胞の作製技術が開発され、注目が大きくなっている。miRNA導入により作製された、iPS細胞様細胞(mirPS細胞)は、従来のiPS細胞に比較してリプログラミング効率が20%程度と高効率であり、更に腫瘍形成能が低いとされている。本研究では、このmiRNAと乳歯歯髄細胞(HDDPC)を用いることでmirPS細胞を樹立し、さらにインスリン分泌細胞の分化誘導を行うことにより、より効率の高く安全な再生療法の開発を目的とする。まずは、mirPS細胞を作製するために、HDDPCに対してpLOVE-miR302/367（リプログラミングmiRNA）、pT-EGFP（緑蛍光タンパク）、pT-pac（puromycin耐性遺伝子）、pTrans（PB transposase発現ベクター）、をNeon Transfection Systemによって遺伝子導入した。また導入後にpuromycinにて選別して、生じたコロニーを拾い上げて安定株を得た。現在、緑蛍光の確認、ALP染色による未分化性の確認、PCRによるゲノム解析を行っている。

在再生研究中，正在进行IPS细胞的积极研究。在生产中，需要引入四个名为Yamanaka因子的四个初始化基因，但其基因引入效率不高，并且仍然存在肿瘤形成的风险。为了解决这些问题，近年来，已经开发了使用微RNA（miRNA）的IPS细胞的产生，并给予了注意。与常规IPS细胞相比，通过引入miRNA产生的IPS样细胞（MIRPS细胞）的效率高约20％，据说肿瘤形成较少。在这项研究中，通过使用这种miRNA和牛奶牙科脐带细胞（HDDPC）并提供miRPS细胞并进一步诱导胰岛素分泌细胞的分化，从而开发了更有效，更安全的再生治疗的目的。首先，为了产生mirps细胞，HDDPC插入了MIR302/367（重编程miRNA），PT-EGFP（Glue Tampak），PT-PAC（PT-PAC）（抗蛋白酶抗性基因），PTRAN（PB转疗酶表达载体），Neon Transtection System引入基因。引入后，我们在紫霉素中分类以拾取发生的菌落并获得稳定的菌株。目前，我们正在检查Greenlie，确认由于ALP染色而未实现的特性，并使用PCR进行了基因组分析。