配列選択的組込みにより安全な長期遺伝子発現を実現するトランスポゾンベクターの開発

开发通过序列选择性整合实现安全长期基因表达的转座子载体

基本信息

批准号：
11J01309
负责人：
中西秀之
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

ゲノムへの遺伝子組込みは、遺伝子治療やiPS細胞作製など、幅広く応用される。しかしながら、通常、組込み位置はランダムであるため、内在遺伝子付近への組込みにより、癌化等の変異を誘発する危険性がある。本研究ではこの危険性を低減するために組込み位置選択性を向上することを目的としている。前年度においては、標的配列を有するプラスミドDNAへの組込みにおいて、位置選択性を45倍向上可能であることを示した。しかしながら、遺伝子治療やips細胞作製においてはプラスミドDNAではなくゲノムに遺伝子を組込む必要があり、プラスミドDNAとゲノムではサイズや核内タンパク質との相互作用等に大きな違いがある。したがって、より厳密な評価のためには、組込み先のDNAとしてゲノムを用いて検討を行う必要があった。そこで本年度は、ゲノムへの組込みにおいて、位置選択性が向上可能であるかを検討した。細胞内へ導入したDNAを、配列選択的DNA結合タンパク質を用いてゲノム上の標的配列に固定した後、組込みを行う酵素であるphiC31インテグラーゼによって導入DNAをゲノムへ組込み、その組込み位置選択性を評価した。また、DNA結合タンパク質による標的配列への固定に十分な時間を検討するため、DNA結合タンパク質発現ベクター導入からphiC31インテグラーゼ発現ベクター導入までに1日または2日の時間差をおいた。加えて、組込まれるDNAを標的配列に固定するための、結合配列数が与える影響についても評価するため、0から66までの異なる数の結合配列をもつDNAを作製し、用いた。その結果、phiC31インテグラーゼ発現ベクター導入までの時間差が2日間、結合配列数4～18において、標的配列近傍への組込みが向上し、最大で対照群の26倍に達した。以上のように、本研究はゲノムへの組込みにおける位置選択性を大きく向上することに成功した。

基因整合到基因组中具有广泛的应用，包括基因治疗和 iPS 细胞生产。然而，由于整合位置通常是随机的，因此存在内源基因附近的整合可能诱发癌变等突变的风险。本研究的目的是提高合并位置选择性以降低这种风险。去年，我们证明，当整合到含有目标序列的质粒 DNA 中时，可以将位置选择性提高 45 倍。然而，在基因治疗和IPS细胞生产中，需要将基因整合到基因组中而不是质粒DNA中，并且质粒DNA和基因组在大小、与核蛋白的相互作用等方面存在显着差异。因此，为了进行更严格的评价，需要使用基因组作为整合的DNA进行研究。因此，今年我们研究了是否有可能提高整合到基因组过程中的位置选择性。使用序列选择性 DNA 结合蛋白将引入细胞的 DNA 固定到基因组上的目标序列后，通过整合酶 phiC31 整合酶将引入的 DNA 整合到基因组中，并评估整合位点选择性。另外，为了检查DNA结合蛋白固定靶序列的足够时间，在引入DNA结合蛋白表达载体和引入phiC31整合酶表达之间允许有1或2天的时间滞后。向量。另外，为了评价结合序列的数量对将要整合的DNA固定至靶序列的影响，制备并使用具有0至66个不同数量的结合序列的DNA。结果，引入phiC31整合酶表达载体的时间差为2天，当连接序列数为4至18时，目标序列附近的整合得到改善，最高达到对照组的26倍。如上所述，这项研究成功地大大提高了整合到基因组过程中的位置选择性。