神経回路網形成過程におけるチロシンキナーゼFes/Fpsの役割

酪氨酸激酶Fes/Fps在神经网络形成过程中的作用

基本信息

批准号：
17790188
负责人：
高橋秀典
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Himeji Dokkyo University (2006)Kobe University (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までの研究成果として我々は神経回路網形成にかかわる分子の一つとしてチロシンキナーゼであるFes/Fpsを同定した。本年度はチロシンキナーゼと微小管の動態調節の関係を明らかにするためにマクロファージなどに発現するチロシンキナーゼについて変異株を作成し、機能発現時における微小管ダイナミクスへの影響を解析した。具体的にはまずインビトロでマクロファージを経て破骨細胞へと分化成熟させ、骨吸収を刺激依存性に定量する解析方法を確立した。またヒト白血病細胞株HL60を、M-CSF、RANKL、ビタミンD3など各種分化因子の存在下で、マクロファージ様の分化を経てTRAP(酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ)陽性かつ多核の成熟破骨細胞様に分化した。さらに骨吸収の定量的解析法として、象牙質切片上で破骨細胞を分化成熟させ、ATP刺激により形成した吸収窩の数を定量する方法を確立した。そこで微小管に影響を与えるチロシンキナーゼとしてSykに着目し、shRNA-Sykの永久発現型のHL60を作成して上記方法で解析した。こうしてSykの下流で、微小管の翻訳後修飾が影響を受ける事、微小管のアセチル化のダイナミクスが骨吸収に必須であることを確認した。これら成果の一部は本年中に発表予定である。今後は動画による解析を中心にさらに詳細な分子動態を追跡してチロシンキナーゼを介した細胞骨格の変化とリソソーム様顆粒の放出過程を分子作用機序として明らかにする。さらにチロシンキナーゼの発現を抑制した神経細胞を用いて、軸索の形態とその輸送能、もしくは神経回路網形成過程などについても、野生株と比較しつつ解析を進めていく。

根据我们去年的研究结果，我们确定了 Fes/Fps（一种酪氨酸激酶）是参与神经网络形成的分子之一。今年，为了阐明酪氨酸激酶与微管动力学调控的关系，我们创建了在巨噬细胞中表达的酪氨酸激酶突变株，并分析了其功能表达时对微管动力学的影响。具体来说，我们首先在体外通过巨噬细胞将细胞分化并成熟为破骨细胞，并建立了一种以刺激依赖性方式量化骨吸收的分析方法。此外，人白血病细胞系HL60在M-CSF、RANKL、维生素等多种分化因子存在下，通过巨噬细胞样分化，分化为TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）阳性、多核成熟破骨细胞样细胞。 D3 做到了。此外，作为骨吸收的定量分析方法，我们建立了一种在牙本质切片上分化和成熟破骨细胞并定量ATP刺激形成的吸收凹坑数量的方法。因此，我们关注Syk作为影响微管的酪氨酸激酶，创建了永久表达的shRNA-Syk HL60，并使用上述方法对其进行了分析。因此，我们证实微管的翻译后修饰受到 Syk 下游的影响，并且微管乙酰化的动力学对于骨吸收至关重要。其中一些结果计划于今年内公布。未来，我们将重点关注视频分析，以跟踪更详细的分子动力学，并阐明酪氨酸激酶介导的细胞骨架变化和溶酶体样颗粒的释放过程作为分子作用机制。此外，使用酪氨酸激酶表达被抑制的神经元，我们将分析轴突的形态、它们的运输能力以及形成神经网络的过程，同时将它们与野生型细胞进行比较。