網膜背側神経節細胞に特異的に発現する新規分泌性因子の生理機能の解析

视网膜背神经节细胞特异表达的新型分泌因子的生理功能分析

基本信息

批准号：
05J04307
负责人：
山本泰憲
金额：
$ 1.41万
依托单位：
National Institute for Basic Biology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J04307/
关键词：
網膜視蓋投射軸索ガイダンス

项目摘要

本研究では、網膜背側の神経節細胞で特異的に発現する新規分泌性分子の生理機能の解析を行っている。私どもは,ニワトリ網膜内における本分子の発現をshRNAにより抑制すると,背側の視神経軸索が本来とは異なる位置で枝分かれを起こすことを観察している。本分子は分泌性の蛋白質であるため,何らかの受容体を介して軸索の枝分かれを調節しているものと考えられた。そこで本年度は、本分子の受容体の同定を発現クローニング法により試みた。E14のニワトリ網膜と視蓋よりmRNAを単離し、directional cDNA libraryとrandom cDNA libraryを作成した。Directional cDNA libraryを10万クローン及び、random cDNA libraryを210万クローン、本分子とアフカリフォスファターゼまたはFcとの融合蛋白質をプローブに用いてスクリーニングしたが,受容体の単離は成功しなかった。Eph-ephrin系は視神経軸索の枝分かれの位置を調節しており、Ephが機能するためには,Ephと結合したephrinがマトリクスメタロプロテアーゼにより切断される必要があることが知られている。一方,新規分泌性因子はプロテアーゼインヒビター様のドメインを持っている。そこで、本分子がephrinの切断を制御することで,背側の視神経軸索の枝分かれの位置を調節している可能性について検討した。Neuro2A細胞にephrin-A2を発現させ,EphA3の細胞外領域とFcの融合蛋白質を培地中に添加し,マトリクスメタロプロテアーゼを活性化させた。切断されたephrin-A2の量を本分子存在下と非存在下で比較したところ、両者に優位な差は見られなかった。この結果から、本分子による視神経軸索の枝分かれの位置の調節は、ephrinの切断の制御によるものではないと考えられた。

在这项研究中，我们正在分析一种新型分泌分子的生理功能，该分子在视网膜背侧神经节细胞中特异性表达。我们观察到，当该分子在鸡视网膜中的表达被shRNA抑制时，背侧视神经轴突在与原始位置不同的位置分支。由于该分子是一种分泌蛋白，因此认为它通过某种受体调节轴突分支。因此，今年，我们尝试使用表达克隆方法来鉴定该分子的受体。我们从E14鸡视网膜和视顶盖中分离了mRNA，并创建了定向cDNA文库和随机cDNA文库。我们使用该分子与afcari磷酸酶或Fc的融合蛋白作为探针，筛选了定向cDNA文库的10万个克隆和随机cDNA文库的210万个克隆，但我们没有成功分离出受体。 Eph-ephrin 系统调节视神经轴突的分支位置，众所周知，为了使 Ephs 发挥作用，与 Ephs 结合的肝配蛋白必须被基质金属蛋白酶裂解。另一方面，新的分泌因子具有蛋白酶抑制剂样结构域。因此，我们研究了该分子通过控制肝配蛋白分裂来调节背视神经轴突分支位置的可能性。 Ephrin-A2在Neuro2A细胞中表达，并且将EphA3和Fc的胞外区的融合蛋白添加到培养基中以激活基质金属蛋白酶。当比较存在和不存在该分子的情况下切割的肝配蛋白-A2的量时，发现两者之间没有显着差异。这些结果表明，该分子对视神经轴突分支位置的调节不是由于肝配蛋白切断的控制。