Mechanisms of electric axon guidance: regulation of integrin activities by cell surface calcium

电轴突引导机制：细胞表面钙调节整合素活性

基本信息

批准号：
21K06772
负责人：
山下勝幸
金额：
$ 2.66万
依托单位：
International University of Health and Welfare
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度(2021年度)は軸索の細胞膜近傍でカルシウムイオンが非対称的に分布することを明らかにした。即ち、電場内ではカルシウムイオン流が生じ、網膜神経節細胞の軸索表面において陽極側では陰極側より多くのカルシウムイオンが集積することを、カルシウム感受性蛍光色素を用いた画像解析から明らかにした。インテグリンの細胞外ドメインにおいてリガンド結合部位にカルシウムイオンが配位するとリガンドとの親和性が低下し抑制性に活性制御される。従って、電場内では網膜神経節細胞の軸索に発現するインテグリンの活性は陽極側で低下し、陰極側では上昇すると考えられた。インテグリンが活性化するとPI3K-Akt経路を介してGSK3が抑制されることを既に明らかにした(18K06857報告書)。GSK3が抑制されると微小管が安定化されるので、電場内において微小管は軸索の陰極側でより安定化されると予想された。当該年度(2022年度)は、微小管をラベルする蛍光色素(TubulinTracker Green)を用いて網膜神経節細胞の軸索内における微小管の分布を解析した。鶏胚から網膜を摘出し、網膜切片をMatrigel内で21時間培養して神経節細胞の軸索を伸長させた。次に電場内で3時間培養した後、蛍光染色した。その結果、軸索が陰極側へターンする部位において微小管は非対称的に分布することを明らかにした。即ち、微小管は陰極側に偏って分布した。これを定量化するために、asymmetry index (AI)を導入し、微小管の非対称分布を実証した。Nocodazoleで30分間処理した後も同様な結果を得た。これらの結果から、電場内で軸索がターンする場合、微小管は陰極側で安定化されることが明らかになった。軸索は安定化された微小管の方向へ伸長するので、電場内で軸索は陰極側へ伸長すると考えられた。

去年（2021年），我们发现钙离子在轴突细胞膜附近不对称分布。即，使用钙敏感荧光染料的图像分析表明，在电场中发生钙离子流动，并且在视网膜神经节细胞的轴突表面上，阳极侧积聚的钙离子比阴极侧积聚的钙离子多。当钙离子与整联蛋白胞外域的配体结合位点配位时，与配体的亲和力降低，活性受到抑制性控制。因此，在电场中，视网膜神经节细胞的轴突中表达的整合素的活性被认为在阳极侧降低并且在阴极侧增加。我们已经证明，当整合素激活时，GSK3 通过 PI3K-Akt 途径受到抑制（报告 18K06857）。由于当 GSK3 被抑制时微管会稳定，因此预计微管在电场中轴突的阴极侧会更加稳定。在本财年（2022年），我们使用标记微管的荧光染料（TubulinTracker Green）分析了视网膜神经节细胞轴突内微管的分布。从鸡胚胎中取出视网膜，并将视网膜切片在基质胶中培养21小时，以使神经节细胞轴突伸长。接下来，在电场中培养3小时后，进行荧光染色。结果表明，微管在轴突转向阴极的部位不对称分布。即，微管偏向阴极侧分布。为了量化这一点，我们引入了不对称指数（AI）并证明了微管的不对称分布。用诺考达唑治疗 30 分钟后获得了类似的结果。这些结果表明，当轴突在电场中转动时，微管在阴极侧稳定。由于轴突沿稳定微管的方向伸长，因此轴突被认为在电场中向阴极伸长。