微生物酵素の新規活性化機構の解析

微生物酶的新型激活机制分析

基本信息

批准号：
21658026
负责人：
小林達彦
金额：
$ 2.11万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21658026/
关键词：
ニトリル代謝微生物酵素

项目摘要

Nitrile hydratase(以下、NHase)を対象として、本申請者らはこれまでに例のない新規かつユニークな翻訳後活性化機構を発見し"Self-Subunit Swapping"と命名した。本研究では、"Self-Subunit Swapping"で最も重要な役割を果たす"Self-Subunit Swapping"シャペロンタンパク質複合体の機能および翻訳後修飾機構の詳細を解明することを目的とした。Nh1Eタンパク質(以下、eタンパク質)と。(Coイオンを含まない)αサブユニットから構成される複合体αe_2(アポαe_2)にin vitroでCo添加するとCoが取り込まれることを発見した。そこで、アポαe_2から"Coイオンを持たないαサブユニット"と"eタンパク質"をそれぞれ分離・精製した。"Coイオンを持たないαサブユニット"にin vitroでCo添加してもCoが取り込まれなかったが、さらに"eタンパク質"を添加すると"Coイオンを持たないαサブユニット"にはCoが取り込まれた。即ち、αサブユニットへのCoの取り込みは"eタンパク質"依存的であり、この時、"eタンパク質"は、「タンパク質へのCoの挿入」に関与していることから、金属シャペロンとして機能することが示唆された。また、アポαe_2にCoが取り込まれたαe_2を精製し、トリプシン消化後MALDI-TOS/MS解析により、αサブユニットのシステイン残基を調べた結果、翻訳後酸化修飾されていることを実証した。この時、"eタンパク質"は、「システイン残基の酸化」に関与していることから、酸化反応の触媒、すなわち酵素として機能することが示唆された。すなわち、「"Self-Subunit Swapping"シャペロン」として機能するeタンパク質が、「金属シャペロン」、「酸化反応触媒」の新たな2つの機能を持つことを新たに発見した。

对于硝酸水力发酶（NHASE），申请人发现了一种前所未有的新颖和独特的翻译后激活机制，并将其命名为“自助式交换”。这项研究旨在阐明“自subusunit交换”伴侣蛋白复合物的功能和翻译后修饰机制的细节，该机制在“自助互动交换”中起着最重要的作用。 NH1E蛋白（以下称为E蛋白）。我们发现，当体外添加到由α亚基组成的复合体αE_2（apoαe_2）中时，CO被吸收了。因此，分别从APOαE_2分离并纯化了“不包含COION的α亚基”和“ E蛋白”。即使将CO添加到体外没有CO离子的alpha亚基中，CO也没有被合并，但是当添加“ E蛋白”时，将CO纳入了“没有COION的Alpha亚基”中。换句话说，CO进入α亚基的摄取是“ E蛋白”依赖性的，此时，“ E蛋白”参与了“将CO插入蛋白质中”，这表明它是金属伴侣的作用。此外，将CO掺入APOαE_2中的αe_2被纯化，在胰蛋白酶消化后，通过MALDI-TOS/MS分析检查了α亚基的半胱氨酸残基，结果证明它们具有转基因氧化后修饰。此时，“ e蛋白”参与了半胱氨酸残基的氧化”，这表明它是氧化反应的催化剂，即一种酶。换句话说，我们新发现的e蛋白，这些e蛋白作为“自育交换”的“伴侣”功能：两种新功能：具有新功能：金属chaperations和氧化反应。