アジ化物代謝系の分子機能解析

叠氮化物代谢系统的分子功能分析

基本信息

批准号：
07F07432
负责人：
小林達彦
金额：
$ 1.47万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07F07432/
关键词：
代謝分解微生物酵素

项目摘要

アジ化物は、アジ化ナトリウム混入事件で知られるように、極めて猛毒性の高い物質である。多方面で利用されている化合物ではあるが、その多くが毒性や爆発性を有する上に処理技術が不十分であるため、利用が敬遠される傾向にある。一方で、天然アジ化物も存在し、生物によるアジ化物分解が行われているものと予想されるが、どのように生合成・生分解されるかについての報告は全く無く、その代謝(およびそれに関わる酵素および遺伝子)は未解明である。本研究では、アジ化物の分解に関わる酵素をタンパク質・遺伝子レベルで解析し、これらの物質を効率よく分解する条件を検討し無害化するシステムを構築することを目的とした。昨年度、アジ化物分解活性が最大となる最適培養条件を決定したアジ化物分解菌についてさらに解析を行った。アジ化物分解活性が最大となる最適条件で培養して得られた菌体を用いてアジ化物分解酵素の精製を行った。菌体を破砕し、無細胞抽出液を調製した時点でアジ化物分解活性は確認できたが、その活性は低く、菌体破砕によりアジ化物分解酵素が不安定になる可能性が考えられた。従って、無細胞抽出液を大量に調製し、そこからアジ化物分解活性を指標に、酵素精製を開始した。無細胞抽出液を硫酸アンモニウムで分画した後、疎水クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーを組み合わせてアジ化物分解酵素の精製を試みているが、現在、SDS-PAGE上で単一バンドになるレベルまで精製するに至っていない。

叠氮化物是极具毒性的物质，在叠氮化钠污染事件中已知。尽管这些化合物用于许多领域，但其中许多化合物具有毒性和爆炸性，并且治疗技术不足，因此倾向于被使用。另一方面，也有天然的叠氮化物，预计叠氮化物是由生物体进行的，但是没有关于它是生物合成或生物降解的报道，其代谢（及其酶和基因）尚未澄清。这项研究旨在分析参与蛋白质和基因水平上叠氮化物降解的酶，并研究有效降解这些物质的条件，并构建一种使它们无害的系统。去年，对叠氮化物降解细菌进行了进一步的分析，该细菌确定了最佳的叠氮化物降解活性的最佳培养条件。使用在最大化叠氮化物降解活性的最佳条件下培养的细胞纯化叠氮化物降解酶。当细胞被破坏并制备无细胞提取物时，确认了叠氮化物降解活性，但活性较低，并且人们认为由于细菌细胞破坏了叠氮化物降解酶可能会变得不稳定。因此，制备了大量无细胞提取物，并使用叠氮化物降解活性作为指标开始了酶纯化。用硫酸铵分馏无细胞提取物之后，已经合并了各种色谱，例如疏水色谱，阴离子交换色谱，凝胶过滤色谱法和其他色谱法，以纯化叠氮化物降解酶，但尚未在SDS-Page上纯化为单个带纯化。