ニトリル代謝関連酵素群の分子機能解析と有用物質生産への利用

与腈代谢相关的酶的分子功能分析及其在有用物质生产中的应用

• 批准号: 23248013
• 负责人: 小林 達彦
• 金额: $ 11.73万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23248013/
• 关键词: ニトリル; 代謝; 酵素; 精製

平成23年4月に基盤研究(A)に採択され研究を開始したが、本年3月11日の震災により研究機器類や実験試料に被害を受け、研究開始の4月には充分な研究環境が整わない状況であった。さらに、基盤研究(S)の採択通知(平成23年5月31日内定)受けたことから、本基盤研究(A)は今年初めて採択されてから2ヶ月にも満たない研究期間で辞退せざるを得なかった。従って、以下の成果しか得られていない。他のニトリルヒドラターゼ(NHase)の活性中心部分の立体構造解析を参考に、Rhodococcus rhodochrous J1株の低分子量型ニトリルヒドラターゼ(L-NHase)の(αサブユニットの)コバルトに配位している2つの酸化システイン残基(システインスルフィン酸とシステインスルフェン酸)とβサブユニットの2つのアルギニン残基との間で各々塩橋を形成する静電引力が、Self-Subunit Swappingが起こる駆動力として重要であることを極く最近、本申請者らは解明した。しかし、NHaseの構造からだけでは、αサブユニットと(Self-Subunit Swappingシャペロンの)eタンパク質が複合体中でどのような構造をとっているかは不明であり、構造学的見地からSelf-Subunit Swappingを解明するために、本複合体および複合体が直接作用するL-NHaseの立体構造解析を行うことを目的として実験を行った。結晶化に必要な十分量の複合体とL-NHaseを調製するために、L-NHaseのαβ両サブユニットおよびeタンパク質の構造遺伝子を導入したRhodococcus属形質転換体を調製後、大量培養を行った。得られた菌体を破砕後、各種クロマトグラフィーを利用して複合体とL-NHaseの精製を行った。

该研究于2011年4月被选为基础研究（A），并开始研究，但是今年3月11日的地震受到研究设备和实验样本的破坏，到4月，当研究开始时，研究环境没有充分准备。此外，由于我收到了接受基础研究的通知（S）（2011年5月31日的办公室要约），因此自从今年首次选择以来，我在研究期不到两个月后被迫拒绝这项基础研究（a）。 Therefore, only the following results have been achieved: Based on the conformational analysis of the active center portion of other nitrile hydratases (NHase), the applicants have recently discovered that the electrostatic attraction, which forms a salt bridge between two oxidized cysteine ​​residues (cysteine ​​sulfinic acid and cysteine ​​sulfenic acid) and two arginine residues of the beta subunit, which coordinate with cobalt (of the α低分子量硝酸水合物（L-NHASE）的亚基），Rhodococcus rhodochrous J1菌株非常重要，对于自助式交换的驱动力非常重要。但是，基于仅NHASE的结构，目前尚不清楚α亚基和E蛋白（自助补品交换伴侣）的结构在复合体中所处，为了阐明从结构的角度阐明自我益生的交换，我们进行了一次实验，目的是对复杂和L-NHase进行三维分析，以直接进行复杂的复杂分析。为了准备足够数量的结晶所需的复合物和L-NHASE，制备了L-NHASE的αβ亚基和E蛋白的结构基因，然后大量培养。破坏所获得的细菌细胞后，使用各种色谱法纯化了复合物和L-NHASE。