NFκBの選択的な標的遺伝子活性化の機構に関する解析

NFκB选择性靶基因激活机制分析

基本信息

批准号：
10J09328
负责人：
石坂彩
金额：
$ 0.9万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J09328/
关键词：
NF-κB SWI/SNF複合体 HIV-1 転写制御

项目摘要

NF-κBは、免疫・炎症・発生・細胞増殖・アポトーシスやウイルスの増殖などに関与する転写因子である。これらを正しく制御するためにはNF-κBが標的遺伝子を選択的に活性化させる必要があるが、その機構の詳細については未解明な点が多い。近年我々の研究室では、クロマチン構造変換因子であるSWI/SNF複合体とNF-κB Re1B/p52ヘテロダイマーを仲介する新規のcofactorとしてDPF2(REQ)を同定した。DPF2はSWI/SNF複合体やp52と結合する性質があり、SWI/SNF複合体をRelB/p52依存的に標的プロモーターへ誘導することにより、NF-κBの非古典的経路の最下流で機能している。本研究ではNF-κBの新規のcoactivatorを同定することを目的として、DPF2の属するd4ファミリーの他のメンバーであるDPF1,DPF3a,DPF3bと、これらとC末端の構造が類似するPHF10が、代表的なNF-κBダイマーのcoactivatorとして機能するか否かを評価した。NF-κBとSWI/SNF複合体の両方に依存的に発現するレポーター細胞を構築して解析した結果、全ての候補がRelA/p50を含めた複数のNF-κBダイマーのcoactivatorとなりうる可能性が示唆された。その中でも、DPF3遺伝子からスプライシング様式の違いにより産生されるDPF3aおよびDPF3bはTNF-α刺激によって活性化されたRelA/p50ヘテロダイマーによるレポーター活性を最も強く誘導することから、NF-κBの古典的経路で働く有力なcoactivator候補であると考えた。In vitroの解析からDPF3a,DPF3bはどちらもSWI/SNF複合体の構成サブユニットやRelA、p50と直接結合し、TNF-α刺激後の核抽出液を用いた免疫沈降実験からこれらの相互作用は核内で起こっていることが分かった。HIV-1の野生型LTRを用いたクロマチン免疫沈降により標的遺伝子のプロモーター上での三者の挙動を解析すると、DPF3a/bとSWI/SNF複合体は定常的に動員されているのに対しRelA/p50はTNF-α依存的にLTR上へ動員されていた。このRelA/p50の動員のkineticsは転写亢進のkineticsとよく相関していた。このプロモーターの活性化にはSWI/SNF複合体とRelA/p50が揃う必要があり、両者を結び付けるDPF3a/bはcoactivatorとして重要な機能を担っていることが明らかとなった。

NF-κB 是一种参与免疫、炎症、发育、细胞增殖、凋亡和病毒增殖的转录因子。为了正确控制这些，NF-κB需要选择性地激活靶基因，但这种机制的细节仍然很大程度上未知。最近，我们的实验室已确定 DPF2(REQ) 是介导 SWI/SNF 复合物、染色质结构变化因子和 NF-κB Re1B/p52 异二聚体的新型辅助因子。 DPF2具有与SWI/SNF复合物和p52结合的特性，并以RelB/p52依赖性方式引导SWI/SNF复合物到达靶启动子，在NF-κB非经典途径的最下游发挥作用。是。在本研究中，为了鉴定一种新型 NF-κB 共激活因子，我们研究了 DPF1、DPF3a 和 DPF3b（DPF2 所属的 d4 家族的其他成员）以及 PHF10（具有相似的 C 端结构），作为一个代表性的例子，我们评估了它是否作为 NF-κB 二聚体的共激活剂发挥作用。通过构建和分析以依赖性方式表达 NF-κB 和 SWI/SNF 复合物的报告细胞，我们发现所有候选细胞都有可能充当多个 NF-κB 二聚体（包括 RelA/p50）的共激活剂。建议。其中，由于不同剪接模式而由DPF3基因产生的DPF3a和DPF3b，最强烈地通过TNF-α刺激激活的RelA/p50异二聚体诱导报告基因活性，因此我们认为NF-κB的经典途径成为共同激活者工作的有力候选人。体外分析表明，DPF3a 和 DPF3b 都直接与 SWI/SNF 复合物的组成亚基、RelA 和 p50 结合，并且使用 TNF-α 刺激后的核提取物进行的免疫沉淀实验表明，这些相互作用是我们现在知道内部发生了什么核。使用野生型 HIV-1 LTR 通过染色质免疫沉淀分析靶基因启动子上的三个启动子的行为，结果表明 DPF3a/b 和 SWI/SNF 复合物不断被募集，而 RelA /p50 在 TNF-α 中被募集到 LTR 上依赖方式。 RelA/p50 招募的动力学与转录增强的动力学密切相关。该启动子的激活需要 SWI/SNF 复合物和 RelA/p50 的比对，并且已经清楚，结合两者的 DPF3a/b 作为共激活子发挥着重要功能。