ATR依存的なSWI/SNF複合体制御によるDNA複製ストレス解消機構の解明

通过 ATR 依赖性 SWI/SNF 复合物调节阐明 DNA 复制应激缓解机制

• 批准号: 22K18033
• 负责人: 矢野 公義
• 金额: $ 3万
• 依托单位: National Cancer Center Japan
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K18033/
• 关键词: DNA複製ストレス; がん遺伝子; ATRキナーゼ; SWI/SNF複合体; ATR

がん遺伝子活性化は、DNA複製ストレスを増大させ、ゲノム不安定化及び発がんを促進する。ATRキナーゼは、DNA複製ストレスに応答して活性化し、様々なタンパク質をリン酸化することによって、複製フォークの安定化、損傷修復、細胞周期チェックポイントの活性化などを制御する。これまでに、SWI/SNF複合体に遺伝子変異を有するがん細胞がATR阻害剤に対して高感受性を示すことが報告されているが、野生型SWI/SNF複合体とATRの存在下におけるDNA複製ストレス応答機構に関しては十分に解析されていない。本研究では、がん遺伝子誘発性DNA複製ストレスに応答するATR依存的なSWI/SNFタンパク質のリン酸化を同定するとともに、ATR-SWI/SNF複合体によるDNA複製ストレス解消機構を解明することを目的とした。リン酸化プロテオーム解析から、KRAS変異によってATR依存的にリン酸化されるSWI/SNFタンパク質を同定した。また、このリン酸化タンパク質特異的な抗体を用いた免疫染色解析の結果からも、変異型KRASの発現誘導や、KRAS変異がん細胞において、このタンパク質のリン酸化レベルが上昇することが示された。さらに、DNAファイバーアッセイによって、このタンパク質が複製フォークの進行に及ぼす影響について解析した。その結果、siRNAを用いた発現抑制によって複製フォークが失速することが示唆された。これに関して、リン酸化の意義を調べるため、リン酸化部位を変異したタンパク質を発現する細胞株を樹立した。現在、リン酸化タンパク質が複製フォークの進行やその障壁となる要因に与える影響について解析を進めている。

癌基因激活会增加 DNA 复制压力，促进基因组不稳定和癌变。 ATR 激酶响应 DNA 复制应激而被激活，并磷酸化各种蛋白质，从而调节复制叉稳定、损伤修复和细胞周期检查点激活。迄今为止，已有报道SWI/SNF复合物基因突变的癌细胞对ATR抑制剂高度敏感；其复制应激反应机制尚未得到充分分析。在本研究中，我们旨在鉴定响应癌基因诱导的DNA复制应激的SWI/SNF蛋白的ATR依赖性磷酸化，并阐明ATR-SWI/SNF复合物解决DNA复制应激的机制等。通过磷酸化蛋白质组分析，我们鉴定了通过 KRAS 突变以 ATR 依赖性方式磷酸化的 SWI/SNF 蛋白。此外，使用对该磷酸化蛋白具有特异性的抗体进行的免疫染色分析结果显示，突变型KRAS的表达被诱导，且该蛋白的磷酸化水平在KRAS突变型癌细胞中增加。此外，我们使用 DNA 纤维测定分析了该蛋白质对复制叉进展的影响。结果表明，使用 siRNA 抑制表达会阻碍复制叉。在这方面，为了研究磷酸化的意义，我们建立了表达具有突变磷酸化位点的蛋白质的细胞系。我们目前正在分析磷酸化蛋白对复制叉进展的影响以及充当障碍的因素。