腸内細菌の異所性感染に着目したHIV持続感染の慢性炎症維持機構の解析

以肠道细菌异位感染为重点分析HIV持续感染者慢性炎症维持机制

基本信息

批准号：
22K20926
负责人：
石坂彩
金额：
$ 1.83万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-08-31 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20926/
关键词：
HIV 慢性炎症腸内細菌叢細胞外小胞腸内細菌

项目摘要

抗HIV療法によりウイルス複製が良好に制御されている患者においても、体内では慢性炎症が続いている。本研究では、微弱なウイルス複製に伴う持続的な腸管免疫の活性化と、腸管粘膜上皮の腸内細菌叢の破綻に起因すると考えられる腸管バリア機能の低下（leaky gut）による細菌群の血中への侵入（腸内細菌の異所性感染）が、相加的かつ互いに刺激しあう悪循環が起きている可能性を念頭に、腸内細菌叢の破綻を背景とした慢性炎症の維持機構について検証ている。特に、腸内細菌が分泌する細胞外小胞（Extracellular vesicles）にはDNAや二次代謝産物など細菌由来の生理活性物質が含まれており、細菌叢の破綻によって細胞外小胞の構成も変化することで粘膜免疫細胞の活性化につながると仮定し、HIV感染者と健常者の便検体中の細胞外小胞の性状について比較解析を行っている。本年度は、便中の細胞外小胞がどの腸内細菌から分泌されたかを同定する検出系の確立を行った。まず、便検体をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に懸濁し、遠心分離により細菌をペレット（菌体）と上清 (細胞外小胞) に分画した。次に上清を超遠心分離およびセファロースビーズを担体として用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞外小胞を遊離タンパク質から分子サイズの違いによって分離し、回収を行った。精製した細胞外小胞および菌体画分からそれぞれDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子中のV3-V4 領域を次世代シークエンサーで解読した。得られた塩基配列情報から、菌体画分からは腸内細菌叢を構成する細菌種を、細胞外小胞画分からは小胞を分泌した腸内細菌を同定した。

即使在病毒复制受抗HIV治疗很好控制的患者中，体内慢性炎症也会继续。这项研究检查了慢性炎症的机制，其背景是肠道微生物菌群失败的背景，可能是，细菌入侵血液（肠道细菌的异位感染）的恶性循环是由于肠道屏障功能的降低而引起的，这被认为是造成的，这是造成的，这被认为是造成的，这是造成的，这是造成的，这是造成的，这是造成的。发生恶性循环，每个循环都会增加刺激，彼此相互刺激。特别是，由肠道细菌分泌的细胞外囊泡含有源自细菌（例如DNA和次生代谢产物）的生物活性物质，以及细胞囊肿的室外囊泡的结构变化，这是由于细菌菌群的塌陷而导致的，导致粘膜免疫的激活，我们对孔的性能进行了比较的分析，并在孔中进行了比较。今年，我们建立了一个检测系统，以确定粪便中细胞外囊泡的分泌。首先，将粪便标本悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并通过离心将细菌分级为颗粒（细胞）和上清液（细胞外囊泡）。然后将上清液进行超速离心，并使用Sepharose珠作为载体进行超级离心，并通过分子大小差异从游离蛋白分离出细胞外囊泡，然后恢复。从纯化的细胞外囊泡和细胞级分中提取DNA，并使用下一代测序仪对16S rRNA基因中的V3-V4区域进行解密。从获得的碱基序列信息中，从细胞馏分中鉴定出构成肠菌群的细菌种类，从细胞外囊泡分数中鉴定出分泌囊泡的肠道细菌。