緑膿菌エコーシステムにおけるバイオフィルムの酵素・遺伝学的特性解析とその応用

铜绿假单胞菌回声系统中生物膜的酶学和遗传表征及其应用

基本信息

批准号：
13760067
负责人：
橋本渉
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

バイオフィルム(BF)は、微生物の重要な生存様式(エコーシステム)であるが、その系の複雑さのために充分な解析が進んでいない。運動性を有する緑膿菌は、菌体外に多糖アルギン酸を分泌し、これをBFとして周囲から隔離された生存様式を示し、時には重篤な呼吸器疾患を発症する。さらに、BFを分解し遊離することにより、新たな部位へ移動する。BF形成に関わる緑膿菌の運動性には、ポリリン酸キナーゼ(PPK)により合成されるポリリン酸の関与が指摘されている。緑膿菌はペリプラズムにアルギン酸分解酵素(AlgL)を有するが、その遺伝子はアルギン酸合成遺伝子群と同一オペロンに存在している。AlgLの遺伝子と活性発現との相関が不明なため、AlgLの生理的意義とBF分解制御は殆ど未知である。そこで本研究では、緑膿菌BFに焦点を当て、特にPPKとAlgLが各々関わるBF形成及び分解制御機構を明らかにすることを目的とする。AlgL大量発現大腸菌(全タンパク質の約30%)を育種し、精製系を確立した。AlgLは、これまでに当研究室で構造機能相関を明らかにしているSphingomonas属細菌由来の酵素A1-IIIと有意な相同性(30%)を示した。A1-IIIの触媒残基に相当するAlgLのHis202及びTyr256を各々Ala及びPheに置換した変異体は、酵素活性を示さなかった。従って、His202及びTyr256は、AlgLの活性発現に必須であることが明らかになった。今回、同定した触媒残基の知見に基づいて、緑膿菌ゲノム上のAlgL遺伝子に変異を導入することにより、アルギン酸合成系を修飾することなく、AlgLの機能のみを欠失させた変異株の作製が可能となる。今後、本変異株を用いて、BF分解制御機構を解析する。また、運動性を制御するPPKの構造機能相関を明らかにするため、蒸気拡散法を用いたPPKの結晶化を行っている。

生物膜（BF）是微生物的重要生存模式（回声系统），但由于系统的复杂性，充分的分析尚未取得进展。具有活动能力的铜绿假单胞菌在菌体外分泌海藻酸多糖，并以此为BF与周围环境隔离生存，有时会发展成严重的呼吸道疾病。并且，通过分解并解放BF，移动到新的地点。已经指出，由多磷酸激酶(PPK)合成的多磷酸盐参与参与BF形成的铜绿假单胞菌的运动。铜绿假单胞菌的周质中具有藻酸盐降解酶(AlgL)，其基因与藻酸盐合成基因存在于同一操纵子中。由于AlgL基因与活性表达之间的相关性尚不清楚，因此AlgL的生理意义和BF降解的调节在很大程度上是未知的。因此，在本研究中，我们重点关注铜绿假单胞菌 BF，旨在阐明控制 BF 形成和降解的机制，特别是涉及 PPK 和 AlgL 的机制。我们培育了表达大量AlgL（约占总蛋白30%）的大肠杆菌，并建立了纯化系统。 AlgL 与鞘氨醇单胞菌的酶 A1-III 表现出显着的同源性 (30%)，其结构与功能关系已在我们的实验室得到阐明。 AlgL的His202和Tyr256（对应于A1-III的催化残基）分别被Ala和Phe取代的突变体不显示酶活性。因此，表明His202和Tyr256对于AlgL活性的表达是必需的。基于这次鉴定的催化残基的知识，通过在铜绿假单胞菌基因组中的AlgL基因中引入突变，我们创造了一种突变菌株，其中仅删除了AlgL的功能而不改变藻酸盐合成系统。生产。今后，我们将利用该突变菌株来分析控制BF降解的机制。此外，为了阐明控制其运动性的PPK的结构-功能关系，我们使用蒸气扩散法使PPK结晶。