難治性細菌感染症における細菌の増殖、潜伏及び感染持続機構の解析と新規治療法の確立

分析顽固性细菌感染中的细菌生长、潜伏和感染持续机制并建立新的治疗方法

基本信息

批准号：
13226049
负责人：
橋本渉
金额：
--
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

緑膿菌は、多糖アルギン酸をバイオフィルムとして産生し、感染症を誘発する。バイオフィルム細菌感染症は、その強固な菌蓋による抗生物質不透過性のために難治性を示す。従って、難治性バイオフィルム細菌感染症の治療において、バイオフィルムの除去が有効である。本研究では、細菌由来アルギン酸分解酵素(アルギン酸リアーゼ:A1-III)をバイオフィルム除去剤として開発することにより、バイオフィルム細菌感染症の新規治療法の確立を検討している。今年度は、バイオフィルムの破壊に適した無抗原性酵素の調製とその酵素学的・免疫学的性質を解析した。N-ヒドロキシスクシニル化ポリエチレングリコールエステル(PEG)(分子量:2,000、5,000及び12,000)で、A1-IIIのリシン残基を修飾し、その諸特性を未修飾酵素と比較した。50mMリン酸カリウム緩衝液における未修飾体の活性至適pHは7.5であったが、PEG分子量に拘わらず修飾体では至適pHが酸性側にシフトした。未修飾体の活性至適温度は65℃であったが、修飾体では至適温度は低温側にシフトした。PEG分子量に拘わらず、修飾率が70%を越えると急激にKm値が大きくなったが、修飾率70%以下ではKm値は、未修飾体のそれとほぼ一致した。また、Vmaxは、修飾率の増大に従って低下した。未修飾体は60℃の加熱処理により失活したが、修飾体は70℃の熱処理後も90%以上の活性を保持していた。免疫反応性は、PEGの分子量が2,000と5,000の場合には、PEG修飾率の増大に伴って低下した。一方、PEGの分子量が12,000の場合には、Km、Vmaxとも未修飾体と変わらず、抗原性が顕著に低下した。しかし、全ての修飾体は、モルモットに対して極軽度なアナフィラキシー反応を示した。以上の結果より、A1-IIIの無抗原化には、エピトープ部位の除去が有効であることが示された。

铜绿假单胞菌产生藻酸多糖作为生物膜并诱导感染。生物膜细菌感染因其坚固的细菌帽而难以治疗，抗生素无法渗透。因此，去除生物膜可有效治疗难治性生物膜细菌感染。在这项研究中，我们正在研究通过开发细菌藻酸盐降解酶（藻酸盐裂解酶：A1-III）作为生物膜去除剂来建立生物膜细菌感染的新治疗方法。今年，我们制备了一种适合破坏生物膜的非抗原性酶，并分析了其酶学和免疫学特性。 A1-III的赖氨酸残基用N-羟基琥珀酰化聚乙二醇酯(PEG)(分子量：2,000、5,000和12,000)进行修饰，并将其性质与未修饰的酶的性质进行比较。未修饰形式在 50mM 磷酸钾缓冲液中的最佳活性 pH 值为 7.5，但无论 PEG 分子量如何，修饰形式的最佳 pH 值都会向酸性侧移动。未修饰形式的最适活化温度为65℃，但修饰形式的最适温度向低温侧移动。无论PEG分子量如何，当修饰率超过70%时，Km值突然升高，但当修饰率低于70%时，Km值几乎与未修饰的产品相当。此外，Vmax 随着改性率的增加而降低。未修饰形式在60°C热处理后失活，但修饰形式即使在70°C热处理后仍保留90%以上的活性。当PEG分子量为2,000和5,000时，免疫反应性随着PEG修饰率的增加而降低。另一方面，当PEG的分子量为12,000时，Km和Vmax与未修饰产物相比均没有变化，抗原性显着降低。然而，所有修改都在豚鼠中表现出非常轻微的过敏反应。上述结果表明，去除表位位点可以有效地使A1-III无抗原。