高分子物質の結合と分解に関わるタンパク質・酵素の機能を規定する動的高次構造の解析

分析动态高阶结构，定义参与聚合物结合和分解的蛋白质和酶的功能

基本信息

批准号：
15780053
负责人：
橋本渉
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15780053/
关键词：
Bacillus キサンタンリアーゼ X線結晶構造解析多糖リアーゼファミリーヒアルロン酸リアーゼコンドロイチンリアーゼ反応機構動的構造スフィンゴモナス属細菌高分子物質アルギン酸結合タンパク質アルギン酸リアーゼ動的高次構造ドメイン開閉ループ開閉

项目摘要

高分子物質(キサンタン)の分解に関わるBacillus属細菌(GL1株)由来キサンタンリアーゼ(XLY)の構造機能解析を行い、以下のことを明らかにしてきた。XLYは、一次構造に基づいて多糖リアーゼファミリーPL-8に分類される。XLYのX線結晶構造(α5/α5バレル+逆並行βシート)を決定し、XLYが同じPL-8酵素の連鎖球菌ヒアルロン酸リアーゼ(HLY)やコンドロイチンリアーゼ(CLY)と同様の基本骨格を示すことを明らかにした。また、XLY、CLY、及びHLYの活性部位付近の微細な構造が極めて類似していることも見出し、XLYの触媒反応に関わる分子機構を解析することにより、PL-8酵素に共通の触媒反応機構を提示できると考えられた。XLY,HLY,CLYに共通する高次構造に基づき、触媒に直接関与すると考えられたXLYのN194、H246、Y255の部位特異的変異体を作製し、各変異体の酵素学的性質を調べた。N194A、H246A、Y255Fはいずれも野生型に比して活性が1/500以下に低下したことから、これらの3残基がXLYの活性発現に重要であることが示された。このことはPL-8酵素には共通の触媒反応機構があることを支持する結果である。活性低下型変異体であるN194Aのリガンド非結合型、生成物(ピルビン酸マンノース)結合型、及び基質[キサンタン構成最小ユニット(5糖)]結合型の結晶構造を、それぞれ、2.3、1.8、及び2.1Å分解能で決定した。得られた高次構造に基づき、Y255が酸触媒・塩基触媒として機能する触媒反応機構を提唱した。XLYの触媒反応機構は、これまでHLYの構造に基づいて提唱されていたものとは異なり、むしろCLYにおいて提唱されたものと類似していた。PL-8酵素における共通の高次構造や触媒残基の知見から、XLY及びCLYに見られる触媒反応機構がPL-8酵素に共通するものであることが強く示唆された。また、リガンド結合によりα5/α5バレルドメインの動的構造変化が認められたことから、今後触媒反応におけるドメインの動的機構を明らかにする。

我们对来自芽孢杆菌（GL1菌株）的黄原胶裂解酶（XLY）进行了结构和功能分析，该酶参与了聚合物（黄原胶）的分解，并阐明了以下内容。 XLY 根据其一级结构被归类为多糖裂解酶家族 PL-8。测定了XLY的X射线晶体结构（α5/α5桶+反平行β片），表明XLY具有与所揭示的相同PL-8酶链球菌透明质酸裂解酶（HLY）和软骨素裂解酶（CLY）相同的基本骨架。那。我们还发现XLY、CLY和HLY活性位点附近的精细结构极其相似，并且通过分析XLY参与催化反应的分子机制，我们发现PL-8酶共有的催化反应机制。被认为有可能呈现基于XLY、HLY和CLY的共同高阶结构，我们创建了XLY的N194、H246和Y255的位点特异性突变体，这些突变体被认为直接参与催化，并研究了每个突变体的酶学性质.与野生型相比，N194A、H246A和Y255F的活性均降低至1/500或更低，表明这三个残基对于XLY活性的表达很重要。这一结果支持了 PL-8 酶具有共同催化反应机制的观点。 N194A（一种活性降低的突变体）的晶体结构分别为 2.3、1.8 和 2.3、1.8、以及 2.3、1.8 和 1.8，分别为未配体、产物（丙酮酸甘露糖）结合和底物 [黄原胶最小单位（五糖）]结合形式以 2.1 Å 分辨率测定。基于所获得的高阶结构，我们提出了Y255充当酸催化剂和碱催化剂的催化反应机理。 XLY的催化反应机理与之前基于HLY结构提出的催化反应机理不同，而与CLY提出的催化反应机理非常相似。对 PL-8 酶中常见高阶结构和催化残基的了解强烈表明，在 XLY 和 CLY 中观察到的催化反应机制对于 PL-8 酶是常见的。此外，由于我们观察到配体结合时α5/α5桶结构域的动态结构变化，我们将阐明该结构域在催化反应过程中的动态机制。