予後不良がんの予知と克服を目指したオーロラ関連分子の細胞内ダイナミクス研究

极光相关分子的细胞内动力学研究旨在预测和克服癌症的不良预后

基本信息

批准号：
21591730
负责人：
達家雅明
金额：
$ 2.41万
依托单位：
Prefectural University of Hiroshima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

予後不良がんの予知と克服を目指したオーロラ関連分子の細胞内ダイナミクスを解明するために、本年度は次の実験をおこなった。(1) ヒト大腸がん組織サンプルを用いた発現分布と予後不良との「相関関係」を明らかにするために、外科手術時に得られる組織よりがん部分と周辺正常部分を分離し、それぞれ、病理組織切片を作成後、病理免疫組織染色により解析をおこなった結果こオーロラ関連分子の中で、baculoviral IAP repeat-containing 5 (BIRC5)/apoptosis inhibitor 4/survivinが正常組織と較べて大腸癌組織での高い発現が最も広く認められ、細胞質にsurvivin陽性を認める症例において予後不良との相関があることがわかった。また、外科手術直後に得た非固定非凍結サンプルから細胞質可溶性画分、細胞核可溶性画分、そして不溶性画分(細胞質と細胞核の骨格構造構成蛋白質)の蛋白質を分画抽出し、細胞蛋白質分画後の免疫ブロットをおこなったところ、界面活性剤不溶性画分に加えて、界面活性剤可溶性細胞質画分ならびに核画分に検出される症例があった。これら界面活性剤可溶性画分でのsurvivin陽性症例ほリンパ節転移の症例であり、今後、症例数を増やして統計処理をおこなう予定である。(2) 非転移性の培養細胞をモデルに、EGFP標識したオーロラ関連分子を発現させ、その蛋白質細胞内ダイナミクスを解析した結果、EGFP-survivinを発現させた場合に、アノイキス(接着細胞の接着離脱時に起こるアポトーシスの一形態)に抵抗性となることがわかった。すなわち、survivinはがん転移過程での転移成立に大きな生物学的な障壁のひとつであるアノイキスを克服させてしまうことが示唆された。この時、EGFP-survivinは界面活性剤可溶性画分に分画される。一方、survivinの抗アポトーシスのシグナルを仲介する分子と目されているX-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)も界面活性剤可溶性画分に分画されてEGFP-survivinとの細胞内での結合が免疫沈降実験で確かめられた。また、一方、EGFP-survivinによるアノイキス抑制過程でc-jun N-terminal Kinase (JNK)シグナルが抑制されており、XIAPを介したnuclear factor-kappa B (NF-κB)抑制の結果JNK経路が抑制されることによってアノイキス抑制が起こると推察された。

今年，我们进行了以下实验来阐明极光相关分子的细胞内动力学，旨在预测和克服预后不良的癌症。 (1)为了利用人结肠癌组织样本阐明表达分布与不良预后之间的“相关性”，我们从手术过程中获得的组织中分离出癌变区域和周围正常区域，并在制备组织病理学组织切片后进行分析使用病理免疫组织学染色，在极光相关分子中检测到杆状病毒 IAP 重复序列 5 (BIRC5)/凋亡抑制剂。结果发现，4/survivin在结肠癌组织中的表达最为广泛，其表达水平高于正常组织，并且在细胞质中发现survivin阳性的病例与不良预后相关。另外，在进行后续的免疫印迹时，从未固定、未冷冻的样品中分离并提取细胞质可溶性部分、细胞核可溶性部分和不溶性部分（构成细胞质和细胞核的骨架结构的蛋白质）中的蛋白质。除表面活性剂不溶部分外，有时在表面活性剂可溶的细胞质和细胞核部分中也检测到。这些表面活性剂可溶部分中的survivin阳性病例是淋巴结转移的病例，我们计划今后增加病例数并进行统计分析。 (2)以非转移培养细胞为模型，表达EGFP标记的极光相关分子，并分析该蛋白的细胞内动力学，我们发现当EGFP-survivin表达时，失巢凋亡（贴壁细胞的粘附脱离）。被发现对细胞凋亡（有时发生的细胞凋亡的一种形式）具有抵抗力。换句话说，有人认为生存素克服了失巢凋亡，失巢凋亡是癌症转移过程中建立转移的主要生物障碍之一。此时，EGFP-存活蛋白被分级为表面活性剂可溶级分。另一方面，X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）被认为是介导生存素抗凋亡信号的分子，也被分馏成表面活性剂可溶级分，其在细胞内与EGFP-结合。免疫沉淀实验证实了这一点。另一方面，在失巢凋亡抑制过程中，c-jun N 末端激酶 (JNK) 信号受到 EGFP-survivin 的抑制，而 JNK 通路由于核因子 kappa B (NF-κB) 抑制而受到抑制通过 XIAP 推断失巢凋亡受到了抑制。