小胞体の品質管理機構に関与する分子シャペロンの解析

内质网质量控制机制中分子伴侣的分析

基本信息

批准号：
11153222
负责人：
徳永文稔
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、小胞体内の折りたたみ異常蛋白質は、分子シャペロンにより識別され、細胞質へ逆行輸送後、プロテアソーム分解されることが明らかになり、この機構は小胞体関連分解と呼ばれる。本研究で我々は、抗血栓薬(ワルファリン)下におけるγ-カルボキシル化不全プロテインCをモデル蛋白として、小胞体関連分解における分子シヤペロンの役割を解析した。まず、BiP、ERp72、PDIをそれぞれ高発現したCHO細胞におけるプロテインCの品質管理を調べたところ、全てのシヤペロン高発現細胞でビタミンK下でも分泌が抑制され、部分的な細胞内分解が見られた。また、ワルファリン下ではERp72高発現細胞では野生型より2倍早く分解されたが、BiPやPDI高発現細胞では分解が遅延した。ERp72高発現細胞で見られた分解促進はシステインプロテアーゼ活性によるものではなく、最終的にはプロテアソーム分解を受けた。また、ERp72高発現細胞ではプロテインCとカルネキシン・カルレティキュリンとの会合が抑制されていた。これらの結果は、従来機能不明であったERp72がカルネキシン・サイクルに抑制的に働き、小胞体関連分解を促進する機能を持つことを示唆した。さらに、プロテインCの分解シグナルをもつL鎖とGEPとを融合させたキメラ蛋白(LC-GFPと略)を用いて逆行輸送過程を解析したところ、プロテアソーム阻害割下ではLC-GFPは経時的に核内凝集体を形成した。この凝集体近傍にはプロテアソームが局在すること、また凝集体は核内でもND/PML bodyと呼ばれる特異的部位に蓄積することを明らかにした。この部位は各種神経変性病因蛋白質群の蓄積する部位であり、小胞体関連分解における異常蛋白質の除去機構と神経変性病の成因に共通項があると示唆された。

近年来，人们发现内质网中错误折叠的蛋白质被分子伴侣识别，逆行转运至细胞质，然后被蛋白酶体降解；这种机制称为内质网相关降解。在这项研究中，我们使用γ-羧基化蛋白C作为抗血栓药物（华法林）治疗下的模型蛋白，分析了分子shapeones在内质网相关降解中的作用。首先，我们研究了高表达 BiP、ERp72 和 PDI 的 CHO 细胞中蛋白质 C 的质量控制，发现在所有高表达夏哌隆的细胞中，即使在维生素 K 作用下，其分泌也受到抑制，并且观察到了部分细胞内降解。此外，在华法林作用下，ERp72 高表达的细胞降解速度是野生型的两倍，但 BiP 和 PDI 高表达的细胞降解速度较慢。在ERp72高表达的细胞中观察到的加速降解并不是由于半胱氨酸蛋白酶活性，而是最终经历了蛋白酶体降解。此外，在 ERp72 高表达的细胞中，蛋白 C 与钙联蛋白/钙网蛋白之间的关联受到抑制。这些结果表明，ERp72（其功能以前未知）抑制钙联蛋白循环并促进内质网相关降解。此外，我们使用嵌合蛋白（缩写为LC-GFP）分析了逆行运输过程，其中带有蛋白C降解信号的L链与GEP融合，发现在蛋白酶体抑制下，LC-GFP随着时间的推移形成减少。核内聚集体。我们发现蛋白酶体位于这些聚集体附近，并且聚集体在细胞核内称为 ND/PML 小体的特定位点处积累。该区域是各种引起神经变性的蛋白质积聚的部位，有人认为内质网相关降解中异常蛋白质的去除机制与神经退行性疾病的发病机制之间存在共同特征。