プロテインCをモデルとした異常タンパク質の分泌障害と細胞内分解の解析

以Protein C为模型分析异常蛋白分泌紊乱及细胞内降解

基本信息

批准号：
07780517
负责人：
徳永文稔
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ワルファリン(warfarin)は、ビタミンKの拮抗剤で抗血栓薬として広く臨床応用されている。ワルファリン投与下では、ヒト血中のプロテインC濃度が著減することが知られており、我々はその原因として低γ-カルボキシル化プロテインCは選択的に小胞体内で分解されることを見いだした(Tokunaga et al.Biochemistry34,1163-1170,1995)。本年度研究では、これをさらに進展させ、(1)品質管理機構の細胞種間保存性の検討、(2)低γ-カルボキシル化プロテインCと相互作用する因子の同定、(3)キメラタンパクによる品質管理の異常分子識別機構の解明、(4)小胞体内タンパク分解酵素の同定・精製を試みた。まず、自発的にプロテインCを産生するHepG2細胞を用い解析したところ、ワルファリン存在下ではヒト血中と同様に、プロテインC>X因子>プロトロンビンの順に感受性であり、異常タンパクの非リソソーム領域での分解が見られた。さらに、小胞体-Golgi体移行阻害剤であるBrefeldin Aにより、この分解が阻害されるため、post-ER領域での分解と考えられた。また、DSP架橋実験を行ったところ、プロテインCと、100kDa、80kDaタンパクが架橋され、それぞれGRP94とBiPであると考えられた。キメラタンパクを用いた分泌様式解析では、IX因子のGlaドメインに置換した組み換えプロテインCは、ワルファリンに対する感受性が軽減し、分泌亢進が見られたが、プロトロンビンGlaドメインに置換したキメラ・プロテインCでは、むしろ阻害的であり、プロペプチド領域との連鎖性が示唆された。また、ラット肝ミクロソーム画分に8種の合成基質水解活性を見いだし、DEAE-Sephacel、Q-Sepharose、Blue-Sepharose、Superose12クロマトグラフィーにより、60kDaを主とするシステインプロテアーゼを部分精製した。

华法林是维生素K拮抗剂，作为抗血栓药物在临床上广泛应用。已知在华法林施用下，人血液中的蛋白C浓度显着降低，我们发现其原因是低γ-羧化蛋白C在内质网中被选择性降解（Tokunaga等人，Biochemistry34，1163-1170）。，1995）。在今年的研究中，我们将通过以下方式进一步发展这一点：(1) 检查细胞类型之间质量控制机制的保守性，(2) 识别与低 γ-羧化蛋白 C 相互作用的因子，以及 (3) 使用嵌合蛋白进行质量控制。我们试图阐明管理中识别异常分子的机制，以及（4）识别和纯化内质网蛋白水解酶。首先，我们分析了自发产生蛋白C的HepG2细胞，发现在华法林存在的情况下，它们对蛋白C>因子X>凝血酶原敏感，顺序为蛋白C>因子X>凝血酶原。此外，Brefeldin A（一种内质网-高尔基体转运抑制剂）可抑制这种降解，表明降解发生在内质网后区域。此外，当进行DSP交联实验时，蛋白C与100kDa和80kDa的蛋白交联，分别被认为是GRP94和BiP。使用嵌合蛋白的分泌模式分析表明，用因子 IX 的 Gla 结构域取代的重组蛋白 C 降低了对华法林的敏感性并增加了分泌，但用凝血酶原 Gla 结构域取代的嵌合蛋白 C 反而表现出抑制性，表明与前肽有联系地区。此外，在大鼠肝微粒体组分中发现了八种合成底物的水解活性，并且使用 DEAE-Sephacel、Q-Sepharose、Blue-Sepharose 和 Superose 12 层析对主要为 60kDa 的半胱氨酸蛋白酶进行了部分纯化。