古細菌における分子シャペロンシステムの機能

古细菌分子伴侣系统的功能

基本信息

批准号：
11153206
负责人：
養王田正文
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

超好熱性古細菌 Thermococcus strain KS-1 由来シャペロニンのα,βサブユニットは非常に高い相同性を有しているが,C末端のみ相同性が低い.このC末領域のペプチドを抗原として,各サブユニットに特異的な抗体を作成し,Western Blotting及びELISAにより,菌体内における各サブユニットの量を定量した.その結果,Thermococcus菌体内のシャペロニンでは,生育温度によりオリゴマーのサブユニット組成が異なり,αとβサブユニットのそれぞれが個別に発現制御されていることを明らかにした.αの発現は構成的であり,高温でも発現量は変化しない.一方,βは至適生育温度前後ではαよりも少ないが,温度が上がるに従って発現量が多くなった.また,αホモオリゴマーとβホモオリゴマーの結晶化を試み,αホモオリゴマーの結晶が得られた.T.KS-1のsHspを大腸菌で生産し,その特性を調べた.組換えT.sHspは精製が不十分な状態ではタンパク質の変性中間体に結合する活性はほとんどなかったが,精製度を上げると活性が確認され,Thermoplasma由来Citrate synthaseの熱変性による凝集を防いだ.T.sHspはホモオリゴマーを形成し,その分子量を光散乱法により測定したところ478.6kDaであった.塩基配列から予想されたモノマーの分子量は20kDaであることから24量体であることが予想された.Methanococcus jannashiiのsHspは、結晶構造解析の結果,24量体のサッカーボール型であることが分かっているが,T.sHspも同様な構造を形成していることが示唆される.電子顕微鏡による解析結果もサッカーボール型であることが支持している.また,Pyrococcus horikoshii OT3の2つのPrefoldin遺伝子を大腸菌に組み込む,発現系を構築した.

来源于超嗜热古菌Thermococcus KS-1菌株的伴侣蛋白的α和β亚基具有非常高的同源性，但只有C末端具有较低的同源性。通过Blotting和ELISA对细菌细胞中各亚基的量进行定量。结果表明，热球菌中伴侣蛋白的寡聚体亚基组成随生长温度的不同而不同，并且α和β亚基的表达是单独调节的。 α的表达是组成型的，即使在高温下表达水平也不会改变。另一方面，在最适生长温度附近，β小于α。但随着温度的升高，表达量也随之增加。我们还尝试了α同源寡聚体和β同源寡聚体的结晶，得到了α同源寡聚体的晶体，纯化时几乎没有与变性蛋白中间体结合的活性，但当温度升高时，重组T.sHsp几乎没有与变性蛋白中间体结合的活性。提高了纯化程度，确认了活性，证实重组T.防止了T.sHsp由于热变性而聚集，形成同聚寡聚物，通过光散射法测定其分子量，结果为478.6 kDa。由碱基序列预测的单体的分子量为。 20 kDa，预计是来自甲烷球菌的 24 聚体。晶体结构分析结果发现T. jannashii sHsp呈24聚体足球形状，表明T. sHsp也形成类似的结构。电镜分析结果此外，我们构建了表达系统其中来自 Pyrococcus horikoshii OT3 的两个前折叠蛋白基因被整合到大肠杆菌中。