古細菌のシャペロニンを用いたGroupII型シャペロキンの構造と反応機構の解明

利用古菌伴侣蛋白阐明 II 族型伴侣蛋白的结构和反应机制

• 批准号: 10172236
• 负责人: 養王田 正文
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10172236/
• 关键词: 分子シャペロン; シャペロニン; 古細菌; 超好熱菌; フィラメント; プレフォルディン; sHsp; Thermococcus

Thermococcus KS-1のシャペロニンがMgとATPが存在する条件でFilament構造を形成することを明らかにした.GroupII型シャペロニンと協調して機能すると考えられているPrefoldinの遺伝子をThermococus KS-1から単離した.Prefoldinは複数のサブユニットから構成されているといわれているが,古細菌ではその実体は明らかではない.得られた遺伝子の周囲には候補となる遺伝子が複数存在した.また,オペロンを形成していない可能性があるので,本遺伝子を大腸菌で生産し,精製して抗体を作成した.この抗体を用いた免疫沈降を行いPrefoldinの単離を行う予定である.様々な超好熱性古細菌のゲノム解析の結果,超好熱性古細菌では,良く知られている分子シャペロンとしてはシャペロニンとsHspのみが存在することが分かっている.そこで,Thermococcus KS-1のsHsp遺伝子断片をPCRで増幅し,その配列を基にRACE法により全長遺伝子を単離した.この遺伝子大腸菌に組み込み発現した.発現したsHspは耐熱性であり70度30分間の処理で大腸菌由来の他の蛋白質はほぼ完全に除去された.現在,その機能と特性を解析している.

我们发现，Thermococcus KS-1 的伴侣蛋白在 Mg 和 ATP 存在的情况下形成丝状结构。 Prefoldin是从KS-1中分离出来的，据说Prefoldin由多个亚基组成，但其在古细菌中的实际性质尚不清楚，此外，该基因也有可能存在多个候选基因。由于不形成操纵子，我们在大肠杆菌中产生了该基因，对其进行纯化，并测试其抗炎作用。我们计划使用该抗体进行免疫沉淀并分离Prefoldin。通过对各种超嗜热古菌的基因组分析，我们发现超嗜热古菌中有一种众所周知的分子，已知只有伴侣蛋白和sHsp作为伴侣分子存在。通过PCR扩增KS-1的sHsp基因片段，并根据该序列利用RACE方法分离出全长基因，将该基因整合到大肠杆菌中并表达，表达的sHsp具有耐热性。在70度下处理30分钟，其他来自大肠杆菌的蛋白质几乎被完全去除，目前正在分析它们的功能和特性。