磁気微粒子を用いた遺伝子解析システムの開発

使用磁性粒子的遗传分析系统的开发

基本信息

批准号：
11132102
负责人：
養王田正文
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度作成した磁気分離用マイクロチャンネル内で,以下のモデル実験を行った.目的遺伝子の両端の配列を基に設計したビオチンおよびFITCラベル化プライマーを用いてPCR増幅を行い,得られたDNA断片をアビジン結合磁気ビーズで捕獲した.結合しなかった余剰プライマーやFITCプライマーのみで非特異的に増幅したDNAなどを除去した後,捕獲したDNAをビーズ上で制限酵素処理し,FITCでラベルされたDNA断片を遊離させた.さらに,磁気ビーズをホルムアミド変性液中で加熱することによりFITCを含む一本鎖DNAを遊離させた.各段階で,解離したFITCラベルDNAをシークエンサーで分析した.磁気ビーズ,洗浄用バッファー及び制限酵素溶液などの送液はシリンジポンプで行い,磁気分離は背面から磁石を近づけることにより行った.その結果,マイクロチャンネル内でも磁気微粒子に結合したDNAが効率良く制限酵素で切断されることが分かった.しかし,実験条件によっては,切断されない場合もあった.この原因は磁気上のDNAと酵素の混合が不十分であるためであり,再現性の良い結果を得るためには,混合効率を上げるために磁気微粒子をチャンネル内で分散させる方法の開発が必要である.磁気微粒子を用いたプラスミド構築法の開発した.目的の遺伝子断片を適当な制限酵素切断部位を含む2つのプライマー(Primer l with a digestion site of enzyme l and primer2 with a digestion site of enzyme 2)で増幅する.プライマーの一方(Primer 1)はビオチンでラベルしておく.増幅した断片をアビジン結合磁気ビーズで回収し,ビーズに固定化した状態でEnzyme 2により切断し,あらかじめEnzyme 2で切断しておいたベクターと混合して固定化した状態でLigationさせる.次にEnzyme 1で切断し,遊離したDNA断片をセルフライゲーションさせた後,形質転換に用いる.この方法では,DNA断片を精製,抽出する操作がないので,プラスミド構築の自動化が可能である.

以下模型实验是在去年创建的磁力分离微通道中进行的，使用根据目标基因两端序列设计的生物素和FITC标记的引物进行PCR扩增，并用亲和素捕获所得的DNA片段。仅具有未结合的剩余引物或 FITC 引物的非特异性结合磁珠。除去扩增的 DNA 后，用限制性酶对磁珠进行处理，释放 FITC 标记的 DNA 片段。此外，通过在甲酰胺变性溶液中加热磁珠，在每个步骤中释放 FITC 标记的 DNA 片段。使用测序仪分析解离的 FITC 标记 DNA。使用注射泵输送空气珠、洗涤缓冲液、限制酶溶液等液体，通过从背面接近磁铁进行磁力分离。结果，即使在微通道内，也能有效地限制与磁性粒子结合的DNA。发现该酶能够裂解酶，但是，根据实验条件，也存在不能裂解的情况。这是由于DNA和酶的磁性混合不充分，为了获得可重复的结果，有必要开发一种将磁性颗粒分散在通道内的方法，以提高混合效率。我们开发了一种使用磁性颗粒的质粒构建方法。使用含有适当限制性酶切割位点的两个引物切割感兴趣的基因片段。其中引物（Primer 1）用生物素标记。用亲和素偶联磁珠收集扩增片段，并用亲和素偶联磁珠扩增载体固定化并用酶2切割，与已制备的载体混合。预先用Enzyme 2切割，并以固定化状态连接。接下来，Enzyme将步骤1切割并自连接释放的DNA片段后，用于转化。采用该方法，不需要纯化或提取DNA片段，因此质粒构建可以自动化。