抗生物質の骨格構造を構築する新規ヘム酵素の触媒機構の分光学的・結晶構造学的解析

构建抗生素主链结构的新型血红素酶催化机制的光谱和晶体学分析

• 批准号: 19770120
• 负责人: 平野 聡
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19770120/
• 关键词: 抗生物質性合成系; 酵素; X線結晶構造解析

インドール含有抗生物質の骨格構造を決定する蛋白質について結晶構造解析を用いて研究を進めた。本年度は、ビオラセイン型骨格形成を行う酵素VioEの結晶構造解析と、トリプトファン代謝物からのビオラセイン型骨格とスタウロウスポリン型骨格両方の基となる産物を作るヘム蛋白質StaD及びそのホモログの結晶化に向けての発現・精製条件の検討を行った。酵素VioEは良好な結晶を得ることに成功し、SPring8のビームラインを用いて2.0Åでの構造解析に成功した。VioEは結晶構造中でダイマーを形成しており、それぞれのサブユニットは主に11本のβストランドで構成され、それらは野球グローブのような形の、一層の逆平行βシートを形成していることが明らかになった。各サブユニット中央には正電荷をもつポケットが存在していた。基質アナログとの複合体結晶構造解析と共同研究者による変異体解析結果から、この正電荷をもつポケットがVioEの活性部位であることを明らかにした。さらにドッキングシミュレーションを行い、その結果からVioEの酵素反応メカニズムを提唱した。酵素StaDはこれまで大腸菌による発現系を用いて作製していたが、本年度は共同研究者より提供された放線菌での発現系を用いて発現を行った。放線菌での発現と精製条件を検討した結果、放線菌の発現系で生産した蛋白質は、ヘムの含有量が大腸菌で発現させたものより高く、非特異な分解の程度も少ないので、結晶化サンプルとしてより適していることがわかった。これらのサンプルを用いた結晶化には残念ながら成功していない。これらのサンプルを用いた結晶化には残念ながら成功していないが、今後は、放線菌発現系を用いたStaDホモログ蛋白質の生成条件検索も合わせて行い、結晶化を目指していく。

使用晶体结构分析研究了确定含吲哚抗生素的骨骼结构的蛋白质。今年，我们调查了形成紫紫蛋白型主链的酶Vioe的晶体结构分析，以及血红素蛋白Stad结晶的表达和纯化条件，该蛋白Stad的结晶条件可产生紫roace型型主链的潜在产物，并产生源自thepepebone backone fromptpepean fromptpophan tryptophan trypypophan gromolotiets，并和型号。酶Vioe成功地获得了良好的晶体，并且使用Spring8的光束线在2.0Å下成功进行了结构分析。 Vioe在晶体结构中形成二聚体，每个亚基主要由11个β链组成，这些β链已显示出形成一层反平行β板，形状像棒球手套。每个亚基的中心都有一个带正电荷的口袋。通过底物类似物和合作者的突变分析对复合物的晶体结构分析表明，这个带正电荷的口袋是Vioe的活跃位点。此外，进行了对接模拟，结果提出了VIOE酶促反应的机理。该酶Stad是使用大肠杆菌使用表达系统生产的，但是今年，使用协作者提供的放线菌的表达系统进行了表达式。由于检查放线菌中的表达和纯化条件，发现在放线菌表达系统中产生的蛋白质的血红素含量高于大肠杆菌中的蛋白质，并且非特异性降解的蛋白质更适合于结晶样品。不幸的是，使用这些样品结晶尚未成功。不幸的是，使用这些样品在结晶方面没有成功，但是将来，我们还将使用放线菌表达系统搜索Stad同源物蛋白的生产条件，并旨在进行结晶。