抗生物質の骨格構造を構築する新規ヘム酵素の触媒機構の分光学的・結晶構造学的解析

构建抗生素主链结构的新型血红素酶催化机制的光谱和晶体学分析

基本信息

批准号：
19770120
负责人：
平野聡
金额：
$ 1.66万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19770120/
关键词：
抗生物質性合成系酵素 X線結晶構造解析

项目摘要

インドール含有抗生物質の骨格構造を決定する蛋白質について結晶構造解析を用いて研究を進めた。本年度は、ビオラセイン型骨格形成を行う酵素VioEの結晶構造解析と、トリプトファン代謝物からのビオラセイン型骨格とスタウロウスポリン型骨格両方の基となる産物を作るヘム蛋白質StaD及びそのホモログの結晶化に向けての発現・精製条件の検討を行った。酵素VioEは良好な結晶を得ることに成功し、SPring8のビームラインを用いて2.0Åでの構造解析に成功した。VioEは結晶構造中でダイマーを形成しており、それぞれのサブユニットは主に11本のβストランドで構成され、それらは野球グローブのような形の、一層の逆平行βシートを形成していることが明らかになった。各サブユニット中央には正電荷をもつポケットが存在していた。基質アナログとの複合体結晶構造解析と共同研究者による変異体解析結果から、この正電荷をもつポケットがVioEの活性部位であることを明らかにした。さらにドッキングシミュレーションを行い、その結果からVioEの酵素反応メカニズムを提唱した。酵素StaDはこれまで大腸菌による発現系を用いて作製していたが、本年度は共同研究者より提供された放線菌での発現系を用いて発現を行った。放線菌での発現と精製条件を検討した結果、放線菌の発現系で生産した蛋白質は、ヘムの含有量が大腸菌で発現させたものより高く、非特異な分解の程度も少ないので、結晶化サンプルとしてより適していることがわかった。これらのサンプルを用いた結晶化には残念ながら成功していない。これらのサンプルを用いた結晶化には残念ながら成功していないが、今後は、放線菌発現系を用いたStaDホモログ蛋白質の生成条件検索も合わせて行い、結晶化を目指していく。

我们利用蛋白质晶体结构分析进行了研究，确定了含吲哚抗生素的骨架结构。今年，我们将分析形成紫罗兰素型骨架的酶VioE的晶体结构，并结晶血红素蛋白StaD及其同源物，它们构成紫罗兰素型骨架和十字孢菌素型骨架的基础。为此我们研究了色氨酸代谢物的表达和纯化条件。我们成功获得了酶 VioE 的良好晶体，并使用 SPring 8 光束线成功进行了 2.0 Å 的结构分析。 VioE 在其晶体结构中形成二聚体，每个亚基主要由 11 个 β 链组成，形成一个形状像棒球手套的反向平行 β 折叠。每个亚基的中心都存在一个带正电的口袋。基于与底物类似物的复合物的晶体结构分析以及合作者的突变体分析结果，揭示了这个带正电的口袋是VioE的活性位点。此外，我们还进行了对接模拟，并根据结果提出了VioE的酶反应机理。 StaD 酶以前是使用大肠杆菌表达系统产生的，但今年我们使用合作者提供的放线菌表达系统来表达它。通过对放线菌中表达和纯化条件的检测，发现使用放线菌表达系统产生的蛋白质比大肠杆菌中表达的蛋白质具有更高的血红素含量，并且非特异性降解程度更低，使其成为事实证明它更适合作为样品。不幸的是，使用这些样品的结晶并未成功。不幸的是，使用这些样品的结晶并未成功，但将来我们还将寻找利用放线菌表达系统产生StaD同源蛋白的条件，以达到结晶的目的。