共有結合DNAアプタマーと増殖型レトロウイルスを応用した膵癌免疫療法の開発

使用共价 DNA 适体和繁殖逆转录病毒开发胰腺癌免疫疗法

• 批准号: 22K08837
• 负责人: 平野 聡
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08837/
• 关键词: 膵癌; ICI; DNAアプタマー

膵癌は腫瘍免疫活性が低く、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)の効果が乏しい現状であるが、共有結合DNAアプタマーを応用したICI(Immune checkpoint inhibit covalently-binding aptamers:ICIA)を開発し効果を検証する目的で研究を開始した。DNAアプタマーは生体内でDNAseの影響で速やかに分解されるため、効果が不安定という欠点がある。そこで共有結合を付加し安定したDNAアプタマーの作成の予備実験を施行した。Tabuchiらの論文（Chem. Commun.,2021,57,2483-86）を参考にthrombinに対するaptamer(thrombin binding aptamer:TBA) を共有結合化したアプタマーをコントロールとし、PD-L1に対する共有結合アプタマーを複数作成した。PD-L1に対するアプタマーの塩基配列は複数報告があるが、塩基数が比較的少なく複数検証された、aptPD-L1(Molecular Therapy-Nucleic Acids20165,e397)を選択し、16番目、20番目、45番目のT残基にwarheadを導入した共有結合型アプタマーを作成した。SDS-PAGEで観察すると、コントロールのTBAはthrombinとの結合が確認されたが、PD-L1とcovalent aptamer(T16,T20,T45,3riplet)の４種類はいずれも結合を確認できなかった。Native-PAGやSELEX bufferを用いたり、bufferの種類や条件設定を複数施行したが、いずれも結合を確認できなかった。そこで、癌細胞の増殖因子VEGF165に対する共有結合アプタマーを作成し実験系がワークしているかを検証した。結果、VEGF165共有結合アプタマー（T4,T17,T22）は３種ともVEGFとの結合が確認された。

胰腺癌的肿瘤免疫活性低，免疫检查点（ICI）的作用较差，但会出现ICI（免疫检查点抑制作用）。由于DNase的效果，DNA适体在活体中很快分解，并且具有不稳定的效果。因此，通过添加共享键来创建稳定的DNA适体，进行了初步实验。请参阅Tabuchi的论文（Chem。Commun。创建的数字。有多个报道是适体的基本序列到PD-L1，但是碱的数量相对较小且多次验证，并且第16、20、20、45、45、45、45、20、20、45，创建了第16、20、45）。使用SDS-PAGE观察显示，对照TBA与凝血酶的结合，但无法确认四种类型的PD-L1和共价适体（T16，T20，T45，3RIPP）。使用了本机-PAG和SELEX缓冲液，并强制执行多种类型的缓冲区类型和状况设置，但不能确认它们。因此，我们创建了与癌细胞增殖因子VEGF165的CO结合的附着，并验证了实验系统是否有效。结果，确认了所有三种类型的VEGF165共享加入Aptamer（T4，T17，T22）的结合。