時間分割X線結晶構造解析による鉄硫黄クラスター生合成酵素の触媒反応機構の解明

通过时间分辨X射线晶体结构分析阐明铁硫簇生物合成酶的催化反应机制

基本信息

批准号：
22KJ0453
负责人：
國近航平
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0453/
关键词：
鉄硫黄クラスター生合成 X線結晶構造解析

项目摘要

鉄硫黄（Fe-S）クラスターは多彩な生体反応を触媒する無機補因子であり、主に[2Fe-2S]や[4Fe-4S]の形状でタンパク質と結合している。Fe-Sクラスター生合成酵素IscUは、[2Fe-2S]を[4Fe-4S]へと還元的に変換する「クラスター変換反応」を触媒するが、その詳細な触媒反応機構は不明である。申請者はすでにクラスター変換反応の前駆体である[2Fe-2S]結合型IscUのX線結晶構造解析に成功しており、本研究では、この系を利用して反応中間体の解析を行い、その反応機構を調べる。本年度は、結晶内クラスター変換反応に向けたIscUの精製・結晶化条件の最適化、および変異型IscUを用いた反応中間体の補足を試みた。IscU結晶内でクラスター変換反応を進行させて反応中間体のX線結晶構造を正確に決定するためには、高分解能での構造解析が必要となる。そこで高分解能X線結晶構造解析が可能となる良質なIscU結晶の作成に向けて、IscUの精製・結晶化の条件検討を行った。これまでに複数の条件で結晶が得られているが、高分解能構造解析が可能な結晶は得られていない。また、IscUの活性部位に様々なアミノ酸点変異を導入し、反応中間体または生成物[4Fe-4S]を安定に結合した状態で精製できる変異型IscUの作成を試みた。種々の変異型IscUを発現、精製し、分光学的解析を行うと、そのうち二種類の変異型IscUにおいて、溶液中で反応中間体または[4Fe-4S]結合型IscUが部分的に含まれている可能性が見出された。

铁硫（FE-S）簇是无机辅助因子，可催化多种生物反应，主要以[2FE-2S]和[4FE-4S]的形式与蛋白质结合。 Fe-S簇生物合成酶ISCU催化了“簇转化反应”，将[2FE-2S]还原为[4FE-4S]，但详细的催化反应机制尚不清楚。申请人已经成功地分析了[2FE-2S] - 结合ISCU的X射线晶体学，这是簇转化反应的前体，在这项研究中，对反应中间体的分析将用于研究反应机制。今年，我们试图优化晶体内簇转化反应的ISCU的纯化和结晶条件，并使用突变体ISCU补充中间体。需要高分辨率结构分析，以准确地确定反应中间体的X射线晶体结构，从而在ISCU晶体内进行簇转换反应。因此，为了创建允许高分辨率X射线晶体结构分析的高质量ISCU晶体，研究了ISCU的纯化和结晶条件。到目前为止，已经在许多条件下获得了晶体，但是尚未获得能够进行高分辨率结构分析的晶体。我们还尝试创建一个突变的ISCU，该突变体可以在将各种氨基酸点突变引入ISCU的活性位点并稳定与反应中间或产物[4FE-4S]的状态[4FE-4S]。各种突变体ISCU的表达，纯化和光谱分析表明，这些突变体ISCU中的两个可能包含部分反应中间或[4FE-4S] - 结合溶液中的ISCU。