Mechanism of construction and cyclization of the heme precursor tetrapyrrole

血红素前体四吡咯的构建和环化机制

• 批准号: 22K05321
• 负责人: 佐藤 秀明
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05321/
• 关键词: ヘム生合成; ポルフィリン生合成; テトラピロール; X線結晶構造解析; 酵素反応機構

ヘム生合成経路の途中では、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（HMBS）によって4分子のポルホビリノーゲン（PBG）から合成される鎖状テトラピロールが、ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ（UROS）によってD環ピロールの反転を伴いながら環状化される。本研究では、これらの酵素について立体構造と溶液中での反応の両面から検討を行い、非対称な側鎖配置を持つヘムのポルフィリン環が構築される反応機構の理解を目指している。これまでにヒト由来HMBSについて、ホロ型および、補因子に2分子の基質PBGを連結した反応中間体ES2型で、基質類似体との複合体のX線結晶構造解析に成功し、鎖状テトラピロールの構築過程でPBGがどのように連結されていくのかについて考察してきた。今年度はUROSの詳細な立体構造解析を目指して、まずは結晶の調製に取り組んだ。試料は、大腸菌で大量発現させ、各種のカラムクロマトグラフィーで精製したヒト由来UROSを用いた。基質や反応生成物を含まないUROS単独の結晶化を、シッティングドロップ蒸気拡散法で、大気下、20℃で実施したところ、微結晶やクラスターを得られる有望な結晶化条件がいくつか見つかってきた。一方、UROSと大気下で不安定な反応生成物との共結晶化も嫌気条件下で試行してきたが、これまでのところ適切な結晶化条件は見つかっていない。今後、得られた酵素単独の結晶で、また反応生成物との共結晶を得て、X線結晶構造解析を実施し、テトラピロール環状化の反応機構について考察する予定である。

在血红素生物合成途径的中间，羟基甲基比龙合酶（HMBS）从四个分子（PBG）合成的链四吡咯（pBG）是通过尿中型III合酶（UROS）的D-Erversion d-Enversion d-Ert d-Er d-Erprole perrole perrole pyrole的尿素甲基甲虫合成酶（HMBS）的循环。在这项研究中，我们从三维结构和溶液中的反应中研究了这些酶，并旨在了解构建具有不对称侧链构型的血红素卟啉环的反应机制。到目前为止，我们已经成功地分析了在反应中间ES2类型中人类衍生的HMB的X射线晶体结构，其中两个底物PBG分子与辅因子相关，并研究了在链四吡咯构建过程中如何链接PBG的。今年，我们首先致力于制备晶体，旨在提供详细的UROS三维结构分析。样品是人类衍生的乌罗斯，在大肠杆菌中大量表达，并通过各种柱色谱法纯化。单独的URO的结晶（不包含底物或反应产物）是在20°C下在空气下进行的。使用坐式滴蒸气扩散方法，发现获得了几种有希望的结晶条件，从而允许微晶和簇。另一方面，在厌氧条件下也尝试了UROS的共结晶和在大气中不稳定的反应产物的共结晶，但是到目前为止尚未发现合适的结晶条件。将来，我们计划使用单独获得的酶晶体获得与反应产物的共结晶，并进行X射线晶体结构分析，以讨论四吡俄环化的反应机理。

项目成果

ヘムオキシゲナーゼ1とシトクロムP450還元酵素の複合体形成を利用した二分子間FRETヘムセンサーの開発

利用血红素加氧酶 1 和细胞色素 P450 还原酶之间的复合物形成双分子 FRET 血红素传感器

• 发表时间: 2022
• 作者: 前田圭介;杉島正一;平 順一;坂本 寛
• 通讯作者: 坂本 寛

MALDI-TOF MSを用いた重水素交換質量分析法によるシトクロムP450還元酵素の構造解析

使用 MALDI-TOF MS 通过氘交换质谱法对细胞色素 P450 还原酶进行结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 植村祥太;中村竜太;杉島正一;平 順一;坂本 寛
• 通讯作者: 坂本 寛

フィトクロモビリン合成酵素HY2の中性子結晶構造解析に向けた結晶性改善への取り組み

提高植物色素合成酶 HY2 中子晶体结构分析结晶度的努力

• 发表时间: 2023
• 作者: 藤田有紀;杉島正一;海野昌喜
• 通讯作者: 海野昌喜

ヘム代謝系酵素の複合体形成を利用した二分子間FRETヘムセンサーの開発

利用血红素代谢酶的复杂形成开发双分子 FRET 血红素传感器

• 发表时间: 2022
• 作者: 前田圭介;杉島正一;平 順一;坂本 寛
• 通讯作者: 坂本 寛

MALDI-TOF MSを用いた重水素交換質量分析法によるヘムオキシゲナーゼの構造解析

使用 MALDI-TOF MS 通过氘交换质谱法对血红素加氧酶进行结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 中村竜太;植村祥太;杉島正一;平 順一;坂本 寛
• 通讯作者: 坂本 寛