ショウジョウバエの脚の分化に関わる転写調節因子の構造解析

果蝇腿分化相关转录调控因子的结构分析

• 批准号: 06J10862
• 负责人: 宮園 健一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J10862/
• 关键词: 構造解析; 転写調節; 分化

ショウジョウバエの肢形成に関与する転写調節因子AlとCllは共同的にDNAに結合する。その分子機構の構造学的な基盤を解明するため、Al-Cll-DNA三者複合体の構造機能解析を行った。これらの転写調節因子の共同的なDNA結合に必要な最小領域の決定を行ったところ、Alのホメオドメイン領域およびCllのホメオドメイン領域とその上流14残基、下流6残基の領域が、共同的なDNA結合に必須であることが示された。この領域のCllが存在する条件では、AlホメオドメインのDNAに対する.解離定数(Kd)は、大きく低下することが明らかになった。Al-Cll-DNA三者複合体の立体構造をX線結晶構造解析によって決定した。得られた三者複合体の構造を詳細に解析することにより、AlとCllによる共同的なDNA結合機構に関与する構造上の特徴が明らかになった。一つ目はCllの保存領域の末端に位置する残基とAlホメオドメインとの間の二つの塩橋形成、二つ目は、AlとCllの共同的な作用によって引き起こされるDNAの構造変化である。一つ目の機構によって、タンパク質分子間に塩橋が形成され複合体の安定化がもたらされており、二つ目の機構によって、Clホメオドメイン上流領域によるDNAの minor groove側からの特徴的な塩基認識が可能となっていた。これらの特徴的な構造の形成に関与する残基のアラニン変異体を作成し、その重要性を評価した。その結果、どの変異体に関しても変異導入前のものと比較して三者複合体形成能が低下しており、AlとCllの共同的なDNA結合機構に重要な役割を果たしていることが明らかになった。以上の結果をふまえAlとCllの共同的な複合体形成は 1.AlがDNAに結合、 2.AlとCllが共同的に作用することにより、DNAの mirnor grooveを拡張 3.Clホメオドメイン上流領域がDNAと相互作用し、三者複合体を形成、 4.タンパク質分子間の塩橋形成による複合体の安定化、の4段階で起こると結論付けた。

与果蝇形成有关的转录调节剂Al和Cll共同结合DNA。为了阐明该分子机制的结构基础，对Al-Cll-DNA三方复合物进行了结构功能分析。确定这些转录调节剂的协作DNA结合所需的最小区域表明，Al的同源区域和CLL的同源域区域以及其14和6下游残基对于协作DNA结合至关重要。发现在存在该区域的CLL的条件下，DNA的Al同源域的解离常数（KD）显着降低。通过X射线晶体学分析确定Al-CLL-DNA三分之一复合物的三维结构。对获得的三方复合物的结构的详细分析揭示了Al和Cll所涉及的协作DNA结合机理的结构特征。第一个是在位于CLL和Al同源域的保守区域末端的残基之间形成两个盐桥，第二个是由Al和Cll的协作作用引起的DNA的结构变化。第一种机制导致蛋白质分子之间形成了盐桥，从而导致复合物的稳定，第二种机制允许通过CL同源域上游区域的DNA次要凹槽侧的特征碱识别。创建了参与这些特征结构形成的残基的丙氨酸突变体，并评估了它们的重要性。结果，揭示了与诱变前突变体相比，形成三方复合物的能力降低了，并且在Al和Cll的关节DNA结合机理中起着重要作用。基于上述结果，可以得出结论，Al和Cll的关节复合物在四个阶段发生：1。Al与DNA结合，2。Al和Cll一起工作以扩大DNA的mirnor凹槽； 3。CL同源域的上游区域与DNA相互作用，形成三方复合物，4。通过在蛋白质分子之间形成盐桥来稳定复合物。

项目成果

Cloning, expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of selenomethionine-labelled KaiC-like protein PH0186 from Pyrococcus horikoshii 0T3.

堀越火球菌 0T3 硒代蛋氨酸标记的 KaiC 样蛋白 PH0186 的克隆、表达、纯化、结晶和初步晶体学分析。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Acta Crystallograph Sect F Struct Biol Cryst Commun. 63
• 作者: Ming H;Miyazono K;Tanokura M
• 通讯作者: Tanokura M

Cloning,expression,purification,crystallization and preliminary crystallographic analysis of selenomethionine-labelled KaiC-like protein PHO186 from Pyrococcus horikoshii OT3

堀越火球菌OT3硒代蛋氨酸标记KaiC样蛋白PHO186的克隆、表达、纯化、结晶及初步晶体学分析

• 发表时间: 2007
• 期刊: Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 63
• 作者: K.Inoue;Y.Ashikawa;Y.Usami;H.Noguchi;Z.Fujumoto;H.Yamane;H.Nojiri;Yamamura A;Miyazono K;Miyazono K;Ming H
• 通讯作者: Ming H

新規DNA結合フォールドを持つ制限酵素PabIのX線結晶構造解析

具有新型 DNA 结合折叠的限制性内切酶 PabI 的 X 射线晶体结构分析

• 发表时间: 2007
• 作者: Ming H;Kato Y;Miyazono K;Ito K;Kamo M;Nagata K;Tanokura M;宮園 健一
• 通讯作者: 宮園 健一

Crystal structure of STSO42,a stand-alone RAM moduleprotein,from hyperthermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii strain7

来自超嗜热古菌 Sulfolobus tokodaii 菌株的独立 RAM 模块蛋白 STSO42 的晶体结构

• 发表时间: 2008
• 期刊: Proteins 71
• 作者: K.Inoue;Y.Ashikawa;Y.Usami;H.Noguchi;Z.Fujumoto;H.Yamane;H.Nojiri;Yamamura A;Miyazono K
• 通讯作者: Miyazono K

Novel protein fold discovered in the PabI family of restriction enzymes.

• DOI: 10.1093/nar/gkm091
• 发表时间: 2007
• 期刊: NUCLEIC ACIDS RESEARCH
• 影响因子: 14.9
• 作者: Miyazono, Ken-ichi;Watanabe, Miki;Kosinski, Jan;Ishikawa, Ken;Kamo, Masayuki;Sawasaki, Tatsuya;Nagata, Koji;Bujnicki, Janusz M;Endo, Yaeta;Tanokura, Masaru;Kobayashi, Ichizo
• 通讯作者: Kobayashi, Ichizo