ラット肝臓リゾホスホリパーゼのcDNAクローニングと細胞内シグナル伝達への関与

大鼠肝溶血磷脂酶的cDNA克隆及其参与细胞内信号转导

基本信息

批准号：
06857015
负责人：
杉本博之
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は,ラット肝臓可溶性画分から種々のカラムを使用し,24Kのリゾホスホリパーゼ及び60Kのリゾホスホリパーゼ/トランスアシラーゼをそれぞれ510倍及び20万倍に精製し,すでに均一な標品を得た。両酵素ともホスファチジン酸により活性が阻害されることが判明したが,60Kのリゾホスホリパーゼ/トランスアシラーゼはより著明に阻害され,Kiは10uMであった。また,24Kのリゾホスホリパーゼの抗体を得たところ,60Kのリゾホスホリパーゼ/トランスアシラーゼとは交叉しなかった。我々はさらに,24Kのリゾホスホリパーゼの抗体を使用し,λgt11cDNAライブラリーをスクリーニングし,本酵素のcDNAクローニングを行ないアミノ酸の全配列を得た。この配列は精製した酵素より決定したアミノ酸の部分配列と同一の配列を含んでおり,また,新しい配列であることも確認された。また,我々は,ブタ胃粘膜よりも,免疫学的及びホスファチジル酸への感受性の異なる22K及び23Kのリゾホスホリパーゼを精製した。23Kブタ胃粘膜リゾホスホリパーゼは23Kのラット肝臓リゾホスホリパーゼと交叉したが,23Kブタ胃粘膜リゾホスホリパーゼはラット肝臓リゾホスホリパーゼのどちらの酵素とも交叉しなかった。これらのことはリゾホスホリパーゼの多様性を示しており,それら酵素が精密に調節されていることを示唆すると思われる。

我们使用各种柱从大鼠肝脏可溶性级分中分别纯化24K溶血磷脂酶和60K溶血磷脂酶/转酰基酶510倍和200,000倍，并获得均质制剂。两种酶的活性均被磷脂酸抑制，但 60K 溶血磷脂酶/转酰基酶的抑制更为明显，Ki 为 10 uM。此外，当我们获得 24K 溶血磷脂酶的抗体时，它不与 60K 溶血磷脂酶/转酰基酶交叉。我们进一步利用24K溶血磷脂酶抗体筛选了λgt11 cDNA文库，对该酶进行了cDNA克隆，获得了完整的氨基酸序列。该序列含有与纯化酶确定的相同氨基酸部分序列，并且也被确认为新序列。我们还纯化了与猪胃粘膜具有不同免疫学和对磷脂酰酸敏感性的22K和23K溶血磷脂酶。 23K猪胃粘膜溶血磷脂酶与23K大鼠肝溶血磷脂酶交叉，但23K猪胃粘膜溶血磷脂酶不与大鼠肝溶血磷脂酶中的任何一种酶交叉。这些发现表明溶血磷脂酶的多样性，并表明这些酶受到精确调节。