ニパウイルスのリバースジェネティクス系の確立

尼帕病毒反向遗传学体系的建立

• 批准号: 17790302
• 负责人: 米田 美佐子
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790302/
• 关键词: ニパウイルス; リバースジェネティクス系; リバースジェネティックス系

本研究の目的はニパウイルスのreverse genetics系を作製し、これをウイルス学的基礎研究およびワクチン開発などの応用研究に有用なツールとして確立することである。平成17年度は、ニパウイルス感染細胞から抽出したRNAをもとに、ウイルスゲノム全長(約19kb)を組み込んだプラスミドおよびウイルスレスキューに必要なN、P、L蛋白を発現するためのプラスミドを作製した。これらのプラスミドを用いて、フランス国立医学研究所(INSERM)のP4施設内でウイルスレスキュー実験を行なった。その結果、遺伝子から感染性ニパウイルスを作出することに世界で初めて成功した。平成18年度には、前年度までに確立したリバースジェネティクス系を用いてEGFP発現ニパウイルスを作出することに成功し、各種細胞への感染性の有無を調べた。その結果、ニパウイルスのリセプターの発現とウイルス増殖の有無が一致しない細胞があることを見いだした。さらに、ウイルスのインターフェロン耐性などへの関与が考えられている、アクセサリー蛋白の機能を解析するため、V,C,Wそれぞれを欠損させたウイルスの作出にも成功した。これら組換えウイルスの性状については、現在解析を行なっている。さらに、ニパウイルスのN,P,M,Lの構造蛋白について大腸菌発現系を作製した。各蛋白にはGSTタグを付加し、このタグを利用して大腸菌のlysateから目的の蛋白を回収精製した。精製した蛋白をウサギに免疫してポリクローナル抗体を作製した。これら抗体は、各蛋白の細胞内動態解析の基礎研究、また感染動物からの抗原の検出やサンドイッチ法での抗体診断等にも役立てられる。本研究成果により、組換えニパウイルスの作製が可能になり、ウイルス学的基礎研究、ワクチン開発などへの応用が期待される。

这项研究的目的是为NIPAH病毒创建一个反向遗传学系统，并将其确立为基本病毒学研究和应用研究（例如疫苗开发）的有用工具。在2005年，基于从NIPAH病毒感染的细胞中提取的RNA制备，制备了包含全病毒基因组长度（约19 kb）的质粒（约19 kb）和用于表达N，P和L蛋白的质粒。这些质粒用于在美国国家医学研究所（INSERM）的P4设施中进行病毒救援实验。结果，它是世界上第一个从基因中产生传染性尼帕病毒的一种。 2006年，我们使用直到上一年建立的反向遗传学系统成功地生产了表达EGFP的NIPA病毒，并检查了它是否对各种细胞具有感染性。结果，发现某些细胞与NIPAH病毒受体的表达不匹配，并且存在或不存在病毒生长。此外，为了分析辅助蛋白的功能，辅助蛋白的功能被认为与干扰素耐药性有关，我们已经成功地产生了在V，C和W中缺乏的病毒。当前正在分析这些重组病毒的特性。此外，为N，P，M和L的NIPAH病毒的N，P，M和L的结构蛋白制备了大肠杆菌表达系统。每个蛋白质都用GST标签连接，并使用此标签收集靶蛋白并从大肠杆菌中的裂解物中纯化。将纯化的蛋白质免疫到兔子以产生多克隆抗体。这些抗体对于分析每种蛋白质的细胞内动力学以及从感染动物的抗原以及使用三明治方法诊断抗体的基础研究很有用。这项研究结果将使重组NIPAH病毒的产生能够产生，并有望应用于基本的病毒学研究和疫苗开发中。

项目成果

Expression and characterization of the recombinant swine interleukin-6.

重组猪白细胞介素 6 的表达和表征。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis. 28
• 作者: Nuntaprasert;A. et al.
• 通讯作者: A. et al.

Host range and receptor utilization of canine distemper virus analyzed by recombinant viruses; involvement heparin-like molecule in CDV infection.

重组病毒分析犬瘟热病毒的宿主范围和受体利用；

• 发表时间: 2006
• 期刊: Virology 359
• 作者: N.Nagata;(Editor Tetsuya Mizutani);Yoneda M.et al.;Fujita K.et al.
• 通讯作者: Fujita K.et al.

Expression and purification of recombinant swine interleukin-4.

• DOI: 10.1016/j.cimid.2004.03.012
• 发表时间: 2005
• 期刊: Comparative immunology, microbiology and infectious diseases
• 作者: A. Nuntaprasert;Y. Mori;Kentaro Fujita;M. Yoneda;R. Miura;Kyoko Tsukiyama-Kohara;Chieko Kai