ヒト胎児肝細胞cDNAライブラリーを用いた造血幹細胞増幅因子cDNAクローニング

利用人胎肝细胞cDNA文库克隆造血干细胞扩增因子cDNA

基本信息

批准号：
05770796
负责人：
高橋聡
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770796/
关键词：
G-CSF CML 多能性造血幹細胞 cDNAライブラリー GIG-1クローン胎児肝細胞

项目摘要

G-CSFは顆粒球系の分化、増殖因子であるのみならず造血幹細胞をも刺激することが知られている。我々は、先ずG-CSFの刺激に応じて発現が増強される遺伝子cDNAのクローン化を、G-CSFにより分化誘導をうけ、かつ多能性造血幹細胞レベルでの単クローン性増殖性疾患であるCML-CP患者骨髄単核球を用いておこなった。これは分化停止機構で特徴づけられるAMLの病態解明およびその治療に重要な情報を与えるのみならず多能性幹細胞に対する増幅因子に反応して発現増強するマーカー遺伝子としてももちいることができると考えられた。方法としては先ずCML-CP患者骨髄単核球をG-CSF存在下で18時間培養後に回収しRNA抽出後mRANを精製し、lambdagt10cDNAライブラリーを作成し、次にG-CSF刺激、無刺激CML細胞由来のcDNAをスクリーニング用のプローブとして、24個のG-CSF刺激プローブにより特異的にハイブリダイズするクローンを選択した。このうち1クローン(GIG-1)のmRNAは約0.9kbであり、G-CSF刺激CML細胞でその発現が増強する遺伝子であるのみならず、主に骨髄系白血病細胞株で発現することが確認された。さらに我々は同様な手法を用いて胎生期初期造血の場として重要な胎児肝細胞から、造血幹細胞の増殖、分化にかかわる物質の遺伝子クローニングを試みた。すなわち、先ずヒト胎児肝細胞より抽出したmRNAよりcDNAを合成しヒト成人肝細胞mRNAと重複する分画をハイドロキシアパタイト法で除去し、胎児肝細胞に特有な発現cDNAライブラリーを高発現SRalphaプロモーターを有するpME18Sベクターを用いて作製した。今後は、モノクロナール抗体を用いて分離したCD34陽性細胞を対象にスクリーニング後、高度に幹細胞増幅能を有するcDNAのクローン化を行う予定である。

已知G-CSF不仅是粒细胞的分化和生长因子，而且还能刺激造血干细胞。我们首先克隆了G-CSF刺激表达增强的基因的cDNA，并开发了一种由G-CSF诱导分化的单克隆增殖性疾病，是多能造血干细胞水平的单克隆增殖性疾病。这项研究是使用 CML-CP 患者的骨髓单核细胞进行的。该基因不仅为阐明以分化停滞机制为特征的AML的病理学及其治疗提供了重要信息，而且可以用作多能干细胞的表达响应于扩增因子而增强的标记基因。塔。作为一种方法，首先将CML-CP患者的骨髓单核细胞在G-CSF存在下培养18小时，然后收集，提取RNA，纯化mRAN，创建lambdagt10 cDNA文库，然后G- CSF刺激和未刺激的CML 使用细胞来源的cDNA作为筛选探针，选择与24G-CSF刺激探针特异性杂交的克隆。一个克隆（GIG-1）的mRNA约为0.9kb，已证实该基因不仅在G-CSF刺激的CML细胞中表达增强，而且主要在粒细胞白血病细胞系中表达。完成了。此外，我们尝试使用类似的方法从胎儿肝细胞中克隆参与造血干细胞增殖和分化的基因，胎儿肝细胞是早期胚胎造血的重要部位。即，首先，由从人胎儿肝细胞中提取的mRNA合成cDNA，使用羟基磷灰石法去除与人成人肝细胞mRNA重叠的部分，并使用高表达的胎儿肝细胞特异性的表达cDNA文库。 SRalpha 启动子是使用 pME18S 载体创建的。未来，我们计划使用单克隆抗体筛选分离的CD34阳性细胞，然后克隆具有高扩增干细胞能力的cDNA。