ゲノム編集細胞の光学スクリーニングによる機能獲得型変異体ライブラリの迅速創出

通过基因组编辑细胞的光学筛选快速创建功能获得突变体库

• 批准号: 22KJ0572
• 负责人: Hu Xixun
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0572/
• 关键词: CRISPR imaging; CML; Ph chromosome; TKI resistance; CRISPR Imaging; genotyping; cell sorting

プロジェクト概要ゲノム変異はがんなどの疾患の原因の一つであるが、生きた細胞で特定のDNAを検出する技術がないため、研究が制限されている。そこで、CRISPRイメージングを用いて、生きた慢性骨髄性白血病細胞におけるPh染色体を可視化・定量化するプラットフォームを開発し、TKI治療に反応しない2xPh細胞の抵抗性を評価することで、CML患者の治療法開発に貢献することが期待される。この研究を完全に実行するために、私は研究計画を3つのステップに分けました。ステップ1：効果的なゲノム標識のためのRNPベースのCRISPRイメージングを開発する。ステップ2：CML細胞株におけるPh染色体の存在を確認する。ステップ3：2xPh細胞に対する薬剤スクリーニングを実施する。現在の状態ステップ1について：1年目は、RNPベースのCRISPRイメージングを開発しました。これは、dCas9融合体のタンパク質設計の最適化とCRISPRシグナルの最適な観察条件の決定を行った。これらの改善により、U2OS細胞においてChr13と19の検出率（CRISPRシグナルを含む細胞の割合）が約40%から90%へと大幅に向上しました。これらの結果から、本システムはPh染色体のマーカー遺伝子であるBCRとABLの標識にも有効である可能性が示唆されました。2年目には、dCas9-GFPとdCas9-RFPを同時に用いたマルチカラーラベリングシステムを開発しました。この進化により、BCRとABLの共局在を観察し、Ph染色体を特定することが可能になりました。これらの成果により、ステップ1は終了しました。ステップ2について：2年目には、U2OS細胞でCRISPRシグナルが頻繁に検出される、BCRとABL遺伝子を標識する特定の領域を特定しました。現在、このステップに取り組んでいます。

项目概述 基因组突变是癌症等疾病的原因之一，但由于没有技术可以检测活细胞中的特定 DNA，因此研究有限。因此，我们开发了一个平台，利用 CRISPR 成像对活体慢性粒细胞白血病细胞中的 Ph 染色体进行可视化和量化，并通过评估对 TKI 治疗无反应的 2xPh 细胞的耐药性，我们希望为 CML 患者开发一种治疗方法。预计它们将为发展做出贡献。为了全面开展这项研究，我将研究计划分为三个步骤。步骤 1：开发基于 RNP 的 CRISPR 成像以进行有效的基因组标记。步骤2：确认CML细胞系中存在Ph染色体。步骤3：对2xPh细胞进行药物筛选。目前状态 关于第 1 步：第一年，我们开发了基于 RNP 的 CRISPR 成像。这涉及优化 dCas9 融合蛋白的设计并确定 CRISPR 信号的最佳观察条件。这些改进将 U2OS 细胞中 Chr13 和 19 的检测率（含有 CRISPR 信号的细胞的百分比）显着提高，从大约 40% 提高到 90%。这些结果表明该系统对于标记 BCR 和 ABL（Ph 染色体的标记基因）也可能有效。第二年，我们同时使用 dCas9-GFP 和 dCas9-RFP 开发了多色标记系统。这种进化使得观察 BCR 和 ABL 的共定位并识别 Ph 染色体成为可能。有了这些结果，步骤 1 就完成了。关于第二步：第二年，我们确定了标记 BCR 和 ABL 基因的特定区域，这些区域在 U2OS 细胞中经常检测到 CRISPR 信号。我目前正在做这一步。