新規遺伝性腎がんラットのTransgenic rescueと遺伝子機能の解明

新型遗传性肾癌大鼠转基因拯救和基因功能的阐明

基本信息

批准号：
15700315
负责人：
百瀬修二
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Saitama Medical University (2004)Japanese Foundation For Cancer Research (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

新規遺伝性腎がんラットであるNihonラットの腎がん発生の原因が、ヒトのBirt-Hogg-Dube症候群の原因遺伝子であるBHD遺伝子のラットホモログに生じたgerm line mutationであることが明らかになった。本年度は、まず昨年度樹立した野生型Bhd遺伝子導入トランスジェニックNihonラットの表現型の解析を中心に行い、腎発癌の抑制と胎生致死の回避を複数の独立したラインで確認することができた。これらの結果からBhd遺伝子がNihonラットの腎発癌ならびに胎生致死の原因遺伝子であることを最終的に証明できたものと考える。またBhd産物の機能を明らかにする手がかりとして、以下の結果を得た。細胞内でのBhdの局在を、タグを付加した強制発現系を用いて検討した結果、核および細胞質の両方にびまん性に存在することが確認された。臓器における発現など内在性の発現様式に関しては、現在Bhdに対する特異抗体を用いて検討中である。またBhd結合タンパクに関して、Bhdに対する抗体を用いた免疫共沈降法とSDS-PAGEによる検討を行った結果、150kD付近の特異的なバンドを候補として認めた。現在このバンドを切り出し、アミノ酸配列のシークエンスを試みている。Bhdのリン酸化部位に関しては、ウェスタンブロットにより検出されるBhd産物の複数のバンドが、ホスファターゼ処理により、より移動度の速いバンドに収束することを確認した。次に、BhdをN末とC末に二分して発現させたところ、N末にリン酸化部位が存在することが予想された。現在リン酸化部位の候補となるセリン/スレオニンをアラニンに換えたアミノ酸置換Bhd変異体発現プラスミドを作製しており、それらを利用して最終的にリン酸化部位を同定する予定である。また、本研究においてはNihonラット腎癌由来の培養細胞に、Bhd遺伝子発現系を再導入した細胞株の樹立も進めた。現在樹立の最終段階であり、今後これらの細胞株をBhd産物の機能解析のツールとして利用する予定である。

Nihon 大鼠（一种患有新型遗传性肾癌的大鼠）患肾癌的原因已被发现是 BHD 基因的大鼠同源物中发生的种系突变，该基因是导致 Birt-Hogg-Dube 综合征的基因在人类中它变成了。今年，我们首先对去年建立的野生型 Bhd 转基因 Nihon 大鼠进行表型分析，并能够在多个独立品系中证实抑制肾癌发生并避免胚胎致死。我们相信这些结果最终证明Bhd基因是日本大鼠肾癌发生和胚胎致死的致病基因。此外，我们还获得了以下结果作为线索来阐明Bhd产品的功能。使用添加了标签的强制表达系统检查Bhd的细胞内定位，结果证实Bhd广泛存在于细胞核和细胞质中。目前正在使用针对 Bhd 的特异性抗体来研究内源表达模式，例如在器官中的表达。关于Bhd结合蛋白，使用针对Bhd的抗体和SDS-PAGE进行免疫共沉淀，结果将150kD左右的特异条带识别为候选。我们目前正在切掉这条带并尝试对其氨基酸序列进行测序。关于Bhd的磷酸化位点，经Western blotting检测到的Bhd产物的多个条带经磷酸酶处理后，证实会聚成一条迁移率较快的条带。接下来，当Bhd分为N末端和C末端并表达时，预测在N末端存在磷酸化位点。我们目前正在构建氨基酸取代Bhd突变体的表达质粒，其中候选磷酸化位点丝氨酸/苏氨酸被丙氨酸取代，我们计划使用它们来最终鉴定磷酸化位点。此外，在本研究中，我们继续建立了一种细胞系，其中将Bhd基因表达系统重新引入来自日本大鼠肾癌的培养细胞中。我们目前正处于建立的最后阶段，我们计划使用这些细胞系作为Bhd产品功能分析的工具。