インフルエンザウイルスRNA合成反応を制御する宿主因子RAF-2p48の機能解析

控制流感病毒RNA合成反应的宿主因子RAF-2p48的功能分析

基本信息

批准号：
15790241
负责人：
百瀬文隆
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

インフルエンザウイルスゲノムからのRNA合成を促進する宿主因子画分RAF(RNA Polymerase Activating Factor)-2には、ウイルス核タンパク質NP(Nucleocapsid Protein)に対し酸性分子シャペロンとして機能するp48と、RNA認識・結合に関わると予想されるp36が存在する。昨年度の成果より組換え体p48を単独で発現・精製すると多量体化する事が判明したが、RAF-2画分においてp48は多量体化しておらずp36とのヘテロ2量体として存在する。実際、p36上の特定領域にp48が結合する事を証明し、欠損変異体を用いた試験管内および細胞内での解析によって20アミノ酸程度の領域まで結合部位を狭めることに成功した。また、p48はアミノ酸配列上RNA巻き戻し酵素として機能すると推定されているが、どのような標的2本鎖RNAをもちいてもp48単独では有意な巻き戻し滑性を見出すことができなかった。p36の特性を考え合わせ、p48が本来の活性を示すためにはp36のようなRNA結合補助因子を必要とする可能性が考えられる。p36がモデルウイルスゲノムの特定領域に対して優先的に結合する事が明らかと成ったことから、感染細胞内においてウイルスゲノムRNA認識に関与する可能性が示唆された。また、p36がNPとも相互作用しうることが判明し、この相互作用にp36のカルボキシル末端ドメインが関与する事が判明した。このドメインはp48結合部位とは異なることから、p48・p36・NP・ウイルスRNAの4者複合体と成り得ることが判明した。さらに、p36は試験管内においてNP-モデルウイルスRNA複合体形成を促進する活性を持つことが見出された。これらの成果より、p36はp48-NP複合体をウイルスRNA上へと導く役割を担っていると考えられる。

宿主因子分数RAF（RNA聚合酶激活因子）-2促进了来自流感的毒re基因组的RNA合成，其中包含p48，它是病毒核蛋白NP（核蛋白酶蛋白）和p36的酸性分子伴侣的作用，预计与RNA识别和p36有关。去年的结果表明，仅重组P48的表达和纯化会导致多聚化，但是在RAF-2级分中，p48并未多次化，并且作为p36异二聚体存在。实际上，我们已经证明p48与p36上的特定区域结合，并通过使用有缺陷的突变体进行体外和细胞内分析，我们成功地将结合位点缩小到约20个氨基酸的区域。此外，估计P48在氨基酸序列上充当RNA释放酶，但是仅使用P48，就没有发现明显的放松润滑性，无论使用哪种目标双链RNA。考虑到p36的特性，p48可能需要RNA结合辅助因子（例如p36），以便P48表现出其先天活性。已经表明，p36优先与模型病毒基因组的特定区域结合，这表明它可能参与感染细胞中病毒基因组RNA识别。还发现p36也可以与NP相互作用，并且p36的羧基末端结构域参与了这种相互作用。由于该结构域与P48结合位点不同，因此发现它可以形成P48，P36，NP和病毒RNA的四部分复合物。此外，发现p36具有促进NP模型病毒RNA复合物的活性。基于这些结果，据信p36在将P48-NP复合物引导到病毒RNA中起作用。