インフルエンザウイルス遺伝子の転写・複製を制御する宿主因子RAF-2の機能解析

控制流感病毒基因转录和复制的宿主因子RAF-2的功能分析

基本信息

批准号：
13770153
负责人：
百瀬文隆
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770153/
关键词：
インフルエンザウイルス宿主因子 RNAポリメラーゼ核タンパク質

项目摘要

1.p36タンパク質の同定と遺伝子クローニング:精製RAF-2画分に含まれる36kDaタンパク質p36をリジルエンドペプチダーゼで消化し、産物であるペプチド群の分子量を質量分析装置によって測定した。得られた分子量に合致するペプチドのアミノ酸配列を検索したところ、ある既知遺伝子から翻訳されるタンパク質の部分配列と合致することが判明した。この遺伝子配列に基づいて、ヒトHeLa細胞由来cDNAライブラリーからPCR法によりp36遺伝子断片を増幅し、クローニングを行った。2.組換えp36タンパク質の作製と欠損変異体の作製:得られたp36遺伝子から発現ベクターを構築し、大腸菌による組換えタンパク質の調製を試みたが、発現産物の分子量は予想アミノ酸配列の推定分子量に満たないものであった。p36遺伝子3'末端側に大腸菌では出現頻度の低いコドンが連続している為、翻訳が中断されているものと考えられる。実際、p36タンパク質をアミノ末端側およびカルボキシル末端側の2ドメインに分断した欠損変異体の作製を試みた結果、アミノ末端欠損変異体の翻訳が途中停止していることが判明した。3.培養真核細胞によるp36タンパク質の発現と局在部位の同定:大腸菌では組換え体の調製が困難なため真核細胞内での発現を試みた。エピトープタグを融合したp36タンパク質の真核細胞用発現ベクターを構築しHeLa細胞にDNA導入を行ったところ、約36kDa野生型タンパク質の発現が確認できた。このときp36とp48が細胞核内において共局在していることが、抗p48抗体を用いた共染色により判明した。次に、組換えバキュロウイルスを作製し昆虫細胞によるGST融合p36タンパク質の調製を行った。得られたGST-p36を用いたGSTプルダウン法によってp48-p36相互作用を試験管内でも確認することができた。

1.p36蛋白的鉴定和基因克隆：用赖氨酰内肽酶消化纯化的RAF-2级分中含有的36kDa蛋白p36，并使用质谱仪测量所得肽组的分子量。当我们搜索与获得的分子量相匹配的肽的氨基酸序列时，我们发现它与从已知基因翻译的蛋白质的部分序列相匹配。基于该基因序列，通过PCR从人HeLa细胞衍生的cDNA文库中扩增并克隆p36基因片段。 2.重组p36蛋白的产生和缺失突变体的产生：由获得的p36基因构建表达载体，并尝试使用大肠杆菌制备重组蛋白，但表达产物的分子量是估计分子预测的氨基酸序列的重量小于该值。据认为，翻译被中断是因为 p36 基因的 3' 端包含连续密码子，而这些密码子在大肠杆菌中出现频率较低。事实上，当我们试图创建一个 p36 蛋白被分成两个结构域（氨基末端和羧基末端）的缺失突变体时，我们发现氨基末端缺失突变体的翻译在中途停止。 3.p36蛋白在真核细胞培养中的表达及其定位位点的鉴定：由于在大肠杆菌中制备重组蛋白比较困难，我们尝试在真核细胞中表达它。当我们构建了与表位标签融合的 p36 蛋白真核表达载体并将 DNA 导入 HeLa 细胞时，我们证实了大约 36 kDa 的野生型蛋白的表达。此时，与抗p48抗体的共染色显示p36和p48共定位于细胞核内。接下来，我们创建了重组杆状病毒，并使用昆虫细胞制备了 GST 融合的 p36 蛋白。可以使用获得的GST-p36通过GST pull-down方法在体外证实p48-p36相互作用。