インフルエンザウイルス分節化ゲノムの自己組織化に不可欠な塩基配列の決定とその応用

流感病毒分段基因组自组装必需核苷酸序列的测定及其应用

基本信息

批准号：
21K07056
负责人：
百瀬文隆
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

インフルエンザウイルスの8分節化したRNAゲノムが子孫ウイルス粒子へ選択的にパッケージングされるメカニズムは不明だが、異分節間の特異的な塩基対形成によると考えられている。本研究では、この選択的分節集合に必須の塩基配列すなわちパッケージングシグナルを1塩基解像度で決定することを目的とする。本年度は、これまで用いてきたインターカレーション法による定量RT-PCR(RT-qPCR)やサンガー法シークエンシングなどの測定手法を見直し、精度および信頼性の向上を行った。具体的には、分節比測定RT-qPCRを蛍光標識TaqManプローブによる系へ変更したほか、次世代型シークエンサーによる1分子シークエンシング系の構築を目指した。まず解析対象であるA/Puerto Rico/8/34株およびA/Aichi/2/68株の各8分節について、既存プライマーで増幅したDNA断片に結合するTaqManプローブを設計した。その際、塩基長・融点・禁忌配列など設計諸条件を最適化した。この新規プローブと既存プライマーセットを用いて計4組の「多重検出可能な異なる2分節」を決定し、10～1,000,000コピーの範囲を定量可能なRT-qPCR系を確立した。次に1分子シークエンシングにも使用する8分節共通の逆転写プライマーを設計した。これまで8分節比の測定では、各分節のDNA断片増幅用フォワードプライマー計8種を等モル混合し逆転写プライマーとしていた。新たに、8分節で共通するゲノム5'端12塩基へハイブリダイズし固有分子識別子等をテーリングさせたプライマーを作成した。このプライマー1種類のみ逆転写に使用してRT-qPCRにより8分節が均等検出できることを確認した。さらにRT-qPCR用プライマー・プローブセットは検量線不要のデジタルPCR法でも使用可能であり、高精度な8分節比の測定も可能となった。

尚不清楚流感病毒的8段RNA基因组有选择地包装到后代病毒颗粒中的机制，但据信是由于异孔之间的特定碱基配对所致。这项研究旨在以一个基础分辨率确定该选择性节段集所必需的基本序列或包装信号。今年，我们审查了使用Intercalation方法和Sanger方法测序的测量方法，例如定量RT-PCR（RT-QPCR），这些方法已被用作直到现在，以提高准确性和可靠性。具体而言，除了使用荧光标记的Taqman探针更改分段比率测量RT-QPCR为系统之外，其目的还可以使用下一代测序系统构建单个分子测序系统。首先，对于A/Puerto rico/8/34的八个段和A/AICHI/2/68菌株，这是分析的主题，设计了与现有引物扩增的DNA片段结合的Taqman探针。在这种情况下，优化了各种设计条件，例如基本长度，熔点和禁忌序列的序列。使用此新的探针和现有底漆集，确定了四组“多个检测不同的2个段”，并建立了RT-QPCR系统，可以量化10至1,000,000份的范围。接下来，设计了一个常见的8节逆转录引物，该引物也用于单分子测序。到目前为止，在测量8个截面比，总共八个用于扩增每个段的DNA片段的正向引物混合了等摩尔以形成逆转录引物。新创建了一个底漆，其中基因组与8个段中基因组5'末端共有的12个碱基杂交，并量身定制了一个唯一的分子标识符等。只有一种类型的该引物用于逆转录，并确认RT-QPCR可以均匀地检测到8个片段。此外，可用于RT-QPCR的底漆和探针设置可以与不需要校准曲线的数字PCR方法一起使用，从而可以测量高度准确的8截面比。