インフルエンザウイルス分節化ゲノムの自己組織化に不可欠な塩基配列の決定とその応用

流感病毒分段基因组自组装必需核苷酸序列的测定及其应用

基本信息

批准号：
21K07056
负责人：
百瀬文隆
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

インフルエンザウイルスの8分節化したRNAゲノムが子孫ウイルス粒子へ選択的にパッケージングされるメカニズムは不明だが、異分節間の特異的な塩基対形成によると考えられている。本研究では、この選択的分節集合に必須の塩基配列すなわちパッケージングシグナルを1塩基解像度で決定することを目的とする。本年度は、これまで用いてきたインターカレーション法による定量RT-PCR(RT-qPCR)やサンガー法シークエンシングなどの測定手法を見直し、精度および信頼性の向上を行った。具体的には、分節比測定RT-qPCRを蛍光標識TaqManプローブによる系へ変更したほか、次世代型シークエンサーによる1分子シークエンシング系の構築を目指した。まず解析対象であるA/Puerto Rico/8/34株およびA/Aichi/2/68株の各8分節について、既存プライマーで増幅したDNA断片に結合するTaqManプローブを設計した。その際、塩基長・融点・禁忌配列など設計諸条件を最適化した。この新規プローブと既存プライマーセットを用いて計4組の「多重検出可能な異なる2分節」を決定し、10～1,000,000コピーの範囲を定量可能なRT-qPCR系を確立した。次に1分子シークエンシングにも使用する8分節共通の逆転写プライマーを設計した。これまで8分節比の測定では、各分節のDNA断片増幅用フォワードプライマー計8種を等モル混合し逆転写プライマーとしていた。新たに、8分節で共通するゲノム5'端12塩基へハイブリダイズし固有分子識別子等をテーリングさせたプライマーを作成した。このプライマー1種類のみ逆転写に使用してRT-qPCRにより8分節が均等検出できることを確認した。さらにRT-qPCR用プライマー・プローブセットは検量線不要のデジタルPCR法でも使用可能であり、高精度な8分節比の測定も可能となった。

流感病毒的八节段RNA基因组被选择性包装成子代病毒颗粒的机制尚不清楚，但被认为是由于不同节段之间的特定碱基配对所致。本研究的目的是确定这种选择性分割的必需核苷酸序列，即具有单核苷酸分辨率的包装信号。今年，我们回顾了迄今为止使用的测量方法，例如使用插层法的定量 RT-PCR (RT-qPCR) 和桑格测序，以提高准确性和可靠性。具体来说，除了将分割率测量RT-qPCR更改为使用荧光标记TaqMan探针的系统外，我们的目标是使用下一代测序仪构建单分子测序系统。首先，为待分析的 A/Puerto Rico/8/34 和 A/Aichi/2/68 菌株的八个片段中的每一个片段设计了与用现有引物扩增的 DNA 片段结合的 TaqMan 探针。当时，对碱基长度、熔点、禁忌序列等各种设计条件进行了优化。使用这种新探针和现有的引物组，我们确定了总共四组“可以多重检测的两个不同片段”，并建立了一个可以定量10至1,000,000拷贝范围的RT-qPCR系统。接下来，我们为这 8 个片段设计了通用的逆转录引物，该引物也用于单分子测序。此前，在测量8片段比例时，将用于扩增各片段DNA片段的总共8种正向引物以等摩尔比例混合并用作逆转录引物。创建了一种新引物，该引物与 8 个片段共有的基因组 5' 端的 12 个碱基杂交，并带有独特的分子标识符。经证实，仅使用这一类引物进行反转录，RT-qPCR 就可以同等地检测到 8 个片段。此外，RT-qPCR用引物/探针组还可用于不需要校准曲线的数字PCR方法，从而可以高精度测量八段比。