コール酸フリー呼吸鎖複合体Ⅳ標品による進化で獲得した核由来サブユニットの機能解明

使用不含胆酸的呼吸链复合物 IV 制剂阐明通过进化获得的核亚基的功能

• 批准号: 22K06130
• 负责人: 伊藤 恭子
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: University of Hyogo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06130/
• 关键词: ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ⅳ; 核遺伝子由来サブユニット; コール酸; 膜タンパク質複合体

呼吸鎖末端酸化酵素である複合体Ⅳは、酸素を水に還元すると共にプロトンを能動輸送する。最も進化した哺乳類酵素は、高度に保存された活性中心を含むミトコンドリアDNA由来の３つのコアサブユニットの周りを進化の過程で獲得した核DNA由来の10個の異なるサブユニットが取り囲んでいる。なぜ進化の過程で10種類ものサブユニットが付加されたのか？それらは、細胞環境に適応して複合体Ⅳによる呼吸活性制御にどのように影響を与えているのか？は基礎研究から医学的研究まで幅広い分野で興味がもたれる研究課題である。ウシ心筋複合体Ⅳの反応機構解明は、既に1.3Å分解能の構造情報を基に行われているが、核DNA由来サブユニットの機能は、解明されていない。その原因は、これまでの構造及び機能解明ではコール酸を用いて酵素を調製したため、酵素当たり10分子程度残存したコール酸が核DNA由来サブユニットと結合し、酵素機能を部分的に阻害すると共に生理活性物質等の結合を妨げていることによる。本研究では、コール酸を全く用いないで、活性が高く結晶化が可能な標品を収率よく得る精製法の改良を常に行っている。本酵素を用いた電子顕微鏡を用いた単粒子構造解析では、2.5Å分解能の構造を得るまでに至った。電顕用の試料調製の方法の改良により更なる分解能の向上を目指している。更に各種生理活性物質や、調節因子、薬剤との共構造を得るための条件検討を進めているが、残念ながら現段階では共構造は得られていない。高分解能構造の決定においてはX線結晶構造解析が優位である。そのため、結晶化条件を主にハンギングドロップ法により検討を進めている。角柱状の結晶を得ることはできているが、結晶構造を得るまでには至っていない。この３次元結晶化法の確立ができれば、リン酸化部位の検証や、制御因子のうち小分子であればソーキング法により導入可能となると考えられる。

复合物 IV 是一种呼吸链末端氧化酶，可将氧气还原为水并主动运输质子。最进化的哺乳动物酶包含三个源自线粒体 DNA 的核心亚基，其中包含一个高度保守的活性中心，周围环绕着十个源自进化过程中获得的核 DNA 的不同亚基。为什么在进化过程中增加了10种亚基？它们如何适应细胞环境并影响复合物 IV 对呼吸活动的控制？是一个从基础研究到医学研究等广泛领域都感兴趣的研究课题。牛心脏复合物 IV 的反应机制已根据 1.3 Å 分辨率的结构信息得到阐明，但核 DNA 衍生亚基的功能尚未阐明。其原因是，在之前阐明其结构和功能的尝试中，酶是用胆酸制备的，因此每个酶大约残留10分子胆酸，它与核DNA衍生的亚基结合，部分抑制了酶的功能，这使得酶的功能受到抑制。这是由于阻止生理活性物质等的结合。在这项研究中，我们不断改进纯化方法，以在完全不使用胆酸的情况下获得高产率的高活性、可结晶样品。使用电子显微镜对该酶进行单颗粒结构分析，得到分辨率为 2.5 Å 的结构。我们的目标是通过改进电子显微镜样品制备方法来进一步提高分辨率。此外，我们目前正在研究获得与各种生理活性物质、调节因子和药物的共结构的条件，但遗憾的是，现阶段尚未获得共结构。 X 射线晶体学在确定高分辨率结构方面具有优越性。因此，我们目前主要使用悬滴法来研究结晶条件。虽然我们已经能够获得棱柱晶体，但我们还没有获得晶体结构。如果能够建立这种三维结晶方法，就可以通过浸泡法验证磷酸化位点并在调控因子中引入小分子。

项目成果

Effects of Interfacial Interactions on Electrocatalytic Activity of Cytochrome c Oxidase in Biomimetic Lipid Membranes on Gold Electrodes

界面相互作用对金电极仿生脂膜细胞色素c氧化酶电催化活性的影响

• DOI: 10.1021/acs.jpclett.2c01765
• 发表时间: 2022
• 期刊: The Journal of Physical Chemistry Letters
• 作者: Kato Masaru;Sano Ryoya;Yoshida Narumi;Iwafuji Masatoshi;Nishiyama Yoshito;Oka Sayuki;Shinzawa-Itoh Kyoko;Nishida Yuya;Shintani Yasunori;Yagi Ichizo
• 通讯作者: Yagi Ichizo

Theoretical Model of the Far-Red-Light-Adapted Photosystem I Reaction Center of Cyanobacterium <i>Acaryochloris marina</i> Using Chlorophyll <i>d</i> and the Effect of Chlorophyll Exchange

利用叶绿素<i>d</i>构建蓝藻<i>Acaryocholis marina</i>远红光适应光系统I反应中心的理论模型及叶绿素交换效应

• DOI: 10.1021/acs.jpcb.2c00869
• 发表时间: 2022
• 期刊: The Journal of Physical Chemistry B
• 作者: Kimura Akihiro;Kitoh-Nishioka Hirotaka;Aota Toshimichi;Hamaguchi Tasuku;Yonekura Koji;Kawakami Keisuke;Shinzawa-Itoh Kyoko;Inoue-Kashino Natsuko;Ifuku Kentaro;Yamashita Eiki;Kashino Yasuhiro;Itoh Shigeru
• 通讯作者: Itoh Shigeru

Diverse reaction behaviors of artificial ubiquinones in mitochondrial respiratory complex I.

• DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102075
• 发表时间: 2022-07
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Uno, Shinpei;Masuya, Takahiro;Zdorevskyi, Oleksii;Ikunishi, Ryo;Shinzawa-Itoh, Kyoko;Lasham, Jonathan;Sharma, Vivek;Murai, Masatoshi;Miyoshi, Hideto
• 通讯作者: Miyoshi, Hideto

Identifying antibiotics based on structural differences in the conserved allostery from mitochondrial heme-copper oxidases.

• DOI: 10.1038/s41467-022-34771-y
• 发表时间: 2022-12-08
• 期刊: NATURE COMMUNICATIONS
• 影响因子: 16.6
• 作者: Nishida, Yuya;Yanagisawa, Sachiko;Morita, Rikuri;Shigematsu, Hideki;Shinzawa-Itoh, Kyoko;Yuki, Hitomi;Ogasawara, Satoshi;Shimuta, Ken;Iwamoto, Takashi;Nakabayashi, Chisa;Matsumura, Waka;Kato, Hisakazu;Gopalasingam, Chai;Nagao, Takemasa;Qaqorh, Tasneem;Takahashi, Yusuke;Yamazaki, Satoru;Kamiya, Katsumasa;Harada, Ryuhei;Mizuno, Nobuhiro;Takahashi, Hideyuki;Akeda, Yukihiro;Ohnishi, Makoto;Ishii, Yoshikazu;Kumasaka, Takashi;Murata, Takeshi;Muramoto, Kazumasa;Tosha, Takehiko;Shiro, Yoshitsugu;Honma, Teruki;Shigeta, Yasuteru;Kubo, Minoru;Takashima, Seiji;Shintani, Yasunori
• 通讯作者: Shintani, Yasunori