NADキナーゼのX線結晶構造解析とタンパク質工学的機能変換

NAD激酶的X射线晶体结构分析及蛋白质工程功能转换

基本信息

批准号：
03J05336
负责人：
森茂太郎
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ポリリン酸とATPの両方をリン酸供与体として利用する、ポリリン酸/ATP-NADキナーゼのアポ型及びホロ型のX線結晶解析を行い、NADキナーゼの基質結合部位と触媒部位の存在状態、並びにNADキナーゼの反応触媒機構を明らかにすることを目的とし、結核菌由来NADキナーゼ(Ppnk)のアポ型、並びに基質であるNADとの複合体(Ppnk-NAD)のX線結晶構造を決定し、以下のことを明らかにした。Ppnkはα/β/αから成るN末端ドメインと、2枚の逆βシートから成るC末端ドメインから構成されており、両ドメイン間のクレフトにNADが1分子結合していた。Ppnkは結晶構造でも、溶液中と同様に4量体の分子構造を形成していた。PpnkとPpnk-NADの構造を比較すると、C末端ドメインに存在する、1本のループの構造が大きく異なっていた。このループは、サブユニット間の結合に関与しており、さらに隣り合うサブユニットにおけるNADの結合に関与していることも示唆された。また、NAD結合サイトの詳細を検討した結果、これまでNADキナーゼの1次構造のアライメントにおいて見いだされていた保存領域が、NAD結合サイト形成に関与していること、並びにNAD結合に関与している新しい保存領域を見いだした。また、NAD結合サイトの形成には、隣り合うサブユニット由来の残基(Asp189及びHis226)が関与していることを明らかにした。以上の知見から、Ppnkにおいてサブユニット間の結合が、NAD結合サイトの形成に重要であることを示した。今回明らかにしたNAD結合サイトの形成に関与しているアミノ酸残基がNADキナーゼ及びそのホモログタンパク質において高度に保存されていること、NADキナーゼが全て多量体の分子構造をとることから、他のNADキナーゼにおいても、Ppnkと同様のNAD結合サイトを形成している可能性を示した。

在这项研究中，使用聚磷酸盐和ATP作为磷酸盐供体的Apo-和Holo型聚磷酸盐/ATP-NAD激酶的X射线晶体学进行了阐明，以阐明NAD激酶的底物结合位点和NAD激酶的催化位点的存在，以及NAD基因酶的压催化机制。目的是确定源自结核分枝杆菌的Apo型NAD激酶（PPNK），以及与NAD（PPNK-NAD）的X射线晶体结构（PPNK-NAD），这是底物，并揭示了以下内容。 PPNK由一个N末端结构域组成，该结构域由α/β/α和一个由两个逆β片组成的C末端结构域组成，其中一个NAD分子与两个域之间的裂解结合在一起。 PPNK还以与溶液相同的方式形成了四聚体分子结构。比较PPNK和PPNK-NAD的结构，位于C末端结构域中的单个环的结构显着差异。该循环也与亚基之间的结合以及相邻亚基中NAD的结合。此外，在检查了NAD结合位点的细节后，我们发现先前在NAD激酶主要结构对齐中发现的保守区域与NAD结合位点有关，以及与NAD结合的新的保守区域。还揭示了来自相邻亚基（ASP189和HIS226）的残留物参与NAD结合位点的形成。从上面的发现中，已经表明，PPNK中亚基之间的结合对于形成NAD结合位点很重要。由于此处揭示的NAD结合位点涉及的氨基酸残基在NAD激酶及其同源蛋白中是高度保守的，并且由于所有NAD激酶都具有多聚体分子结构，因此其他NAD激酶也可能形成与PPNK相似的NAD结合位点。