NADキナーゼのX線結晶構造解析とタンパク質工学的機能変換

NAD激酶的X射线晶体结构分析及蛋白质工程功能转换

基本信息

批准号：
03J05336
负责人：
森茂太郎
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ポリリン酸とATPの両方をリン酸供与体として利用する、ポリリン酸/ATP-NADキナーゼのアポ型及びホロ型のX線結晶解析を行い、NADキナーゼの基質結合部位と触媒部位の存在状態、並びにNADキナーゼの反応触媒機構を明らかにすることを目的とし、結核菌由来NADキナーゼ(Ppnk)のアポ型、並びに基質であるNADとの複合体(Ppnk-NAD)のX線結晶構造を決定し、以下のことを明らかにした。Ppnkはα/β/αから成るN末端ドメインと、2枚の逆βシートから成るC末端ドメインから構成されており、両ドメイン間のクレフトにNADが1分子結合していた。Ppnkは結晶構造でも、溶液中と同様に4量体の分子構造を形成していた。PpnkとPpnk-NADの構造を比較すると、C末端ドメインに存在する、1本のループの構造が大きく異なっていた。このループは、サブユニット間の結合に関与しており、さらに隣り合うサブユニットにおけるNADの結合に関与していることも示唆された。また、NAD結合サイトの詳細を検討した結果、これまでNADキナーゼの1次構造のアライメントにおいて見いだされていた保存領域が、NAD結合サイト形成に関与していること、並びにNAD結合に関与している新しい保存領域を見いだした。また、NAD結合サイトの形成には、隣り合うサブユニット由来の残基(Asp189及びHis226)が関与していることを明らかにした。以上の知見から、Ppnkにおいてサブユニット間の結合が、NAD結合サイトの形成に重要であることを示した。今回明らかにしたNAD結合サイトの形成に関与しているアミノ酸残基がNADキナーゼ及びそのホモログタンパク質において高度に保存されていること、NADキナーゼが全て多量体の分子構造をとることから、他のNADキナーゼにおいても、Ppnkと同様のNAD結合サイトを形成している可能性を示した。

在本研究中，我们对多磷酸盐/ATP-NAD激酶的apo和holo形式进行了X射线晶体分析，该激酶同时使用多磷酸盐和ATP作为磷酸供体，并研究了NAD激酶的底物结合位点和催化位点的状态。存在性和不适用性为了阐明D-激酶的反应催化机制，我们测定了来自结核分枝杆菌的NAD激酶(Ppnk)的apo形式以及与底物NAD的复合物(Ppnk-NAD)的X射线晶体结构如下。被揭露了。 Ppnk由一个由α/β/α组成的N端结构域和一个由两个反向β折叠组成的C端结构域组成，一个NAD分子结合在两个结构域之间的裂口上。 Ppnk在晶体结构以及溶液中形成四聚体分子结构。比较Ppnk和Ppnk-NAD的结构，发现C端结构域的一个环的结构存在显着差异。该环被认为参与亚基之间的结合，并且还参与相邻亚基中 NAD 的结合。此外，通过检查NAD结合位点的细节，我们发现先前在NAD激酶一级结构的比对中发现的保守区域参与了NAD结合位点的形成，并且还参与了NAD结合位点的形成。 NAD 结合已被发现。我们还发现相邻亚基（Asp189 和 His226）的残基参与 NAD 结合位点的形成。上述研究结果表明，Ppnk中亚基之间的键合对于NAD结合位点的形成非常重要。我们发现本研究中揭示的参与 NAD 结合位点形成的氨基酸残基在 NAD 激酶及其同源蛋白中高度保守，并且所有 NAD 激酶都具有多聚体分子结构。 NAD 结合位点与 Ppnk 类似。