結核菌を含むマイコバクテリアの細胞壁合成に関わるタンパク質の構造と機能の解析

结核分枝杆菌等分枝杆菌细胞壁合成相关蛋白的结构和功能分析

基本信息

批准号：
18880041
负责人：
森茂太郎
金额：
$ 1.75万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

結核菌を含むマイコバクテリアが有している特徴的な厚い細胞壁構造の形成に関与しているタンパク質について、その機能と構造の解析を目的として種々の研究を行った。細胞壁構造の主要な脂質成分であるミコール酸の生合成に関与している2種類の結核菌由来酵素、Propionyl-CoA carboxylaseとAcyl-CoA synthetaseについて、大腸菌を宿主とした大量発現株を構築してSDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製した。精製酵素を用い結晶化条件のスクリーニングを行い、得られた結晶を用いて放射光施設での回折データの収集を試みた。また、細菌の細胞壁構造には無機リン酸の重合体であるポリリン酸が関与しているとの報告例があることから、結核菌においてもポリリン酸と細胞壁構造との関連が予想された。そこでポリリン酸合成酵素である結核菌由来ポリリン酸キナーゼについて、大腸菌を宿主とした大量発現株を構築してSDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製を行い、その詳細な酵素学的諸性質を明らかにした。その結果、結核菌由来ポリリン酸キナーゼは、溶液中では活性を保持している状態として6量体を形成していた。また、本酵素はATPを基質としてポリリン酸を合成する反応とその逆反応であるポリリン酸とADPを基質としてATPを合成する反応を触媒するが、速度論的解析からATPよりもADPに対する親和性の方が高いことが示された。両反応ともに、2価の金属イオンが活性の発現には必須であり、その濃度には至適濃度が存在していた。これらの研究結果より、結核菌の細胞壁構造に関与しているタンパク質の機能と構造の一端について明らかにすることができた。

我们进行了各种研究来分析参与分枝杆菌（包括结核分枝杆菌）特征性厚细胞壁结构形成的蛋白质的功能和结构。我们使用大肠杆菌作为两种源自结核分枝杆菌的酶的大规模表达菌株，即丙酰辅酶A羧化酶和酰基辅酶A合成酶，它们参与分枝菌酸（细胞的主要脂质成分）的生物合成其在 SDS-PAGE 上纯化为单条带。我们使用纯化的酶筛选结晶条件，并尝试使用获得的晶体在同步加速器辐射设施中收集衍射数据。此外，由于有报道称作为无机磷酸聚合物的多聚磷酸与细菌的细胞壁结构有关，因此预计在结核分枝杆菌中也存在多聚磷酸与细胞壁结构之间的关系。因此，对于源自结核分枝杆菌的多磷酸激酶（一种多磷酸合成酶），我们以大肠杆菌为宿主构建了大规模表达菌株，将其在 SDS-PAGE 上纯化为单条带，并研究了其详细的酶学特性。揭示了。结果，源自结核分枝杆菌的多磷酸激酶形成六聚体，同时保留其在溶液中的活性。此外，该酶还催化以ATP为底物合成多磷酸的反应，以及以多磷酸和ADP为底物合成ATP的逆反应，但动力学分析显示其对ADP的亲和力高于对ATP的亲和力。更高。在这两个反应中，二价金属离子对于活性的表达都是必需的，并且二价金属离子存在最佳浓度。这些研究结果揭示了结核分枝杆菌细胞壁结构中涉及的一些蛋白质的功能和结构。