全ゲノムデータベースを用いたトラフグ・ミオシン重鎖遺伝子の機能解析

利用全基因组数据库分析虎河豚肌球蛋白重链基因的功能

基本信息

批准号：
03F00331
负责人：
渡部終五
金额：
$ 0.32万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

哺乳類のミオシン重鎖遺伝子(MyHC)には骨格筋タイプ6種、心筋タイプ2種、平滑筋タイプ3種および非筋タイプ3種のアイソフォームが存在することが知られている。このうち、骨格筋タイプ6種のMyHCはゲノム上でクラスターを形成する。この構造は哺乳類の多くの生物間で保存されているため、クラスター構造がMyHCの発現調節に重要な役割を果たしていることが予想される。一方、魚類のMyHCに関する知見は少なく、その正確な数さえも明らかになっていない。そこで本研究では、ゲノム配列が公開されているトラフグを対象にMyHCを解析し、個々の遺伝子につき分子生物学的手法を用いてその発現様式および転写調節機構を明らかにすることを目的とした。まず、トラフグMyHCを増幅するプライマーを設計するため、フグゲノムデータベースを利用してin silicoスクリーニングを行った。当研究室で先に決定したコイMyHCの塩基配列からアミノ酸配列を演繹し、それをTBLASTNプログラムにより縮重コドンを含む塩基配列に変換した。この塩基配列をプローブとしてin silicoスクリーニングを行ったところ、コイMyHCに相同な塩基配列を含む16個のscaffoldが検索された。各scaffoldから相同性を示した領域を抜き出し、WISE2プログラムによりエクソンおよびイントロン領域を推定した。さらに、各配列からイントロンを除いた後、Clustal Wプログラムによりアラインメントし、塩基同一率が高かった領域でプライマーを設計した。次に、骨格筋で発現するMyHCを同定するため、まず、トラフグ骨格筋からISOGEN (Nippon Gene)を用いてtotal RNAを抽出した。続いて、このRNAからSuperScript Plasmid System (Invitrogen)を用いてcDNAライブラリーを構築した。また、抽出したtotal RNAから別途1st strand cDNAを合成し、PCRによるcDNAクローニングのための鋳型とした。今後は、まず、PCRによりトラフグMyHCのcDNAクローニングを行う。続いて、得られたcDNA断片をプローブとしてライブラリースクリーニングを行い、骨格筋で発現するMyHCを同定する予定である。

众所周知，哺乳动物肌球蛋白重链基因（MYHC）具有六种骨骼肌类型，两种心肌类型，三种平滑肌类型和三种非肌肉类型。其中有六种骨骼肌类型，MyHC在基因组上形成簇。由于这种结构在许多哺乳动物的生物中是保守的，因此预计簇结构在调节MYHC表达方面起着重要作用。另一方面，关于鱼类中的myHC的了解很少，甚至确切的数字也未知。因此，在这项研究中，我们在发表了基因组序列的金枪鱼河豚中分析了MYHC，并旨在使用分子生物学技术阐明每个基因的表达和转录调节机制。首先，在计算机筛选中是使用pufferfish基因组数据库进行的，以设计扩增金枪鱼pufferfish myHC的引物。氨基酸序列是从先前由我们的实验室确定的鲤鱼MYHC的核苷酸序列推导的，并将使用TBLASTN程序的氨基酸序列转换为含有简并密码子的核苷酸序列。当将此基本序列用作探针时，进行了硅筛检查，搜索了16个含有carp MyHC基本序列的脚手架。从每个支架中提取了显示同源性的区域，并使用Wise2程序估算了外显子和内含子区域。此外，将每个序列的内含子删除后，将底漆与Clustal W程序对齐，并在具有较高基本身份的区域设计。接下来，为了鉴定在骨骼肌中表达的MYHC，首先使用ISOGEN（Nippon Gene）从金枪鱼puffer鱼骨骼肌中提取总RNA。随后，使用上标质粒系统（Invitrogen）从该RNA构建了cDNA文库。另外，将第一链cDNA与提取的总RNA分别合成，并用作通过PCR克隆的cDNA克隆的模板。从现在开始，PCR将首先执行金枪鱼pufferfish MyHC的cDNA克隆。随后，将获得的cDNA片段作为探针进行筛选，以鉴定在骨骼肌中表达的MYHC。