魚類腸管および腸内細菌由来プロテアーゼの探索と利用

鱼类肠道及肠道细菌来源蛋白酶的寻找及利用

基本信息

批准号：
11876044
负责人：
渡部終五
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

内臓を含めて熟成を利用した水産食品として、カタクチイワシやハタハタを原料とした魚醤油、カツオやイカの塩辛がある。一方、魚類の死後、内在性のプロテアーゼが働き、タンパク質が分解して遊離アミノ酸やペプチドなどが生成し、呈味成分が増大することが知られているが、内臓をも含めて製造する水産発酵食品の熟成過程では、必ずしも魚類に内在するプロテアーゼのみが働くとは考えられない。そこで本研究は、カタクチイワシを主対象に、その腸管および腸内細菌を含む腸内容物から新規プロテアーゼ遺伝子を単離して、魚類の高度利用の資することを目的とした。まず、カタクチイワシの活魚を入手し、腸管およびその内容物を分離せず常法によりmRNAを単離し、市販のキットを用いてcDNAを合成した。さらにこのcDNAをλZAPIIファージベクターに組み込み、ライブラリーを構築した。このcDNAライブラリーにつき、ゼラチン・フィルムやカゼインをコーティングしたメンブレインをレプリカと反応させ、プロテアーゼをスクリーニングした。しかしながら、ファージの宿主である大腸菌由来のプロテアーゼの影響のため、カタクチイワシの腸内細菌由来のプロテアーゼをクローニングすることはできなかった。そこで新たに、カタクチイワシ幽門垂からmRNAを調製してfirst strand DNAを合成した。さらに、既報のデータを参照しつつプライマーを設計し、PCRによりトリプシノーゲンの2種類のアイソフォームをクローン化した。一次構造を演繹したところ、カタクチイワシのトリプシンの構造は他動物種由来のものと高い相同性を示し、本酵素の種々の特徴をよく保存していることが明らかとなった。

使用衰老的渔业，包括内部器官，包括由an鱼沙丁鱼和鲑鱼制成的鱼酱油，以及咸鱼，例如Bonito和Squid。另一方面，众所周知，内源性蛋白酶在鱼死后起作用，蛋白质分解以产生游离的氨基酸和肽，从而增加了风味成分，但不一定认为只有鱼类中的蛋白酶在用内脏器官生产的发酵鱼食品衰老过程中才能起作用。因此，这项研究旨在主要靶向猿猴，并将新颖的蛋白酶基因与肠道含量分离，包括其肠道和肠道细菌，以促进鱼类的高利用。首先，获得了活海葵鱼，并通过常规方法分离mRNA，而无需分离肠道及其含量，并使用市售套件合成cDNA。此外，将此cDNA掺入λzapii噬菌体载体中以构建库。该cDNA文库用于反应明胶膜和酪蛋白包被的膜与复制品，以筛选蛋白酶。但是，由于源自大肠杆菌（噬菌体的宿主）的蛋白酶的影响，不可能克隆源自无定形沙丁鱼肠道细菌的蛋白酶。因此，从海葵幽门浆中制备mRNA以合成第一链DNA。此外，设计引物是参考先前报道的数据，并通过PCR克隆两种类型的胰蛋白酶原同工型。对主要结构的推论表明，橡子沙丁鱼中胰蛋白酶的结构与其他动物物种的同源性高度同源，并且可以很好地保留该酶的各种特征。