二枚貝キャッチ筋の収縮制御機構の解明

双壳类捕获肌收缩控制机制的阐明

基本信息

批准号：
12876047
负责人：
渡部終五
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

二枚貝の閉殻筋(キャッチ筋)が行う低エネルギー消費で長時間の収縮制御機構は、著名な研究者がその解明を目指したにもかかわらず、50年以上にわたって不明のままとされてきた。最近、申請者らは、二枚貝キャッチ筋につき、キャッチ収縮からの弛緩時に筋細胞内の分子量7,000,000以上の巨大弾性タンパク質twitchinがリン酸化することを発見した。そこで本研究では、twitchinのリン酸化部位を同定するとともに、遺伝子工学的手法でtwitchin分子の構造および機能の特徴を明らかにし、キャッチ筋の収縮制御機構につき、この方面からの解明を目指した。まず、ムラサキイガイ前足牽引筋(ABRM)のAキナーゼによるリン酸化反応を行ったところ、1モルあたり3モルのリン酸が取り込まれた。次に、リン酸化twitchinのトリプシン完全消化物から単離したリン酸化ペプチドのアミノ酸配列は、RPSLVDVIPDQPTLQHRおよびRPSMSPAPEVと決定され、それぞれ3残基目のセリンがリン酸化していることが明らかにされた。便宜上、これらペプチドをそれぞれD1およびD2とした。次に、cDNAクローニングの結果、4,536アミノ酸残基のコード領域を含む15.5kbpの塩基配列が決定された。演繹アミノ酸配列のモチーフ構造を解析したところ、キナーゼドメインのほかフィブロネクチン様モチーフとイムノグロブリン様モチーフの繰り返し構造が明らかになった。リン酸化ペプチドD1およびD2は、それぞれN末端から873-889および4,114-4,123残基に位置した。さらに、ABRMからカルポニン様タンパク質を発見し、本タンパク質がABRMアクトミオシンのMg^<2+>-ATPase活性を阻害すること、また、twitchinのリン酸化部位に結合することを明らかにした。

尽管知名的研究人员努力理解，但双壳类捕获肌肉所做的低能消耗和长期收缩控制机制一直未知50多年。最近，申请人发现双壳类捕获肌肉磷酸化巨大的弹性蛋白Twitchin，这是肌肉细胞的分子量超过7,000,000，从而在捕获收缩时放松。因此，在这项研究中，我们鉴定了Twitchin的磷酸化位点，并使用基因工程方法揭示了Twitchin分子的结构和功能特征，并旨在从这个角度阐明捕获肌肉的收缩控制机制。首先，当通过激酶进行贻贝前脚牵引肌（ABR）的磷酸化反应时，每摩尔占据了三摩尔的磷酸盐。接下来，从完整的磷酸化Twitchin的完整胰蛋白酶消化物中分离出的磷酸化肽的氨基酸序列被确定为RPSLVDVDVIPDQPTLQHR和RPSMSPAPEV，表明第三个残基的丝氨酸是磷酸化的。为了方便起见，这些肽分别被指定为D1和D2。接下来，cDNA克隆导致15.5 kbp核苷酸序列，其中包含4,536个氨基酸残基的编码区。对外推氨基酸序列的基序结构的分析揭示了纤连蛋白样和免疫球蛋白样基序以及激酶结构域的重复结构。磷酸肽D1和D2分别位于N端的残基873-889和4,114-4,123。此外，我们从ABR中发现了一种类似Calponin的蛋白，表明该蛋白抑制ABR肌动蛋白的Mg^<2+> - ATPase活性，并与Twitchin的磷酸化位点结合。