敗血症性ショックに関与するMIF遺伝子の発現調節機構の解明

阐明MIF基因参与感染性休克的表达调控机制

基本信息

批准号：
14770212
负责人：
佐々木貴史
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770212/
关键词：
MIF cDNAクローニング大腸菌two hybrid法タンパク質発現

项目摘要

本年度は、昨年度にクローニングしたMIF遺伝子を用い、大腸菌two hybrid法によって相互作用する遺伝子を同定することを目指した。MIF遺伝子を用いてベイトベクターを構築し、DNA配列決定を行い、DNA配列及びタンパク質のフレームがずれていないことを確認した。このベクター及びヒト精巣から作成したcDNAライブラリーを用いて、同時に大腸菌の形質転換を行った。この遺伝子ライブラリーから導入された遺伝子が、MIF遺伝子と相互作用する遺伝子であった場合、薬剤耐性遺伝子が発現する。これらの系を用いてMIF遺伝子と相互作用する遺伝子のスクリーニングを行った。これらのベクターを用いて大腸菌を形質転換し、96の陽性クローンを得た。これらのクローンを培養しDNAを抽出及び遺伝子配列決定をおこなった。詳細に解析を行った結果、7クローンがMIF自身であった。これら7クローンのMIFcDNAの5'末端は同一箇所ではないことから、独立して相互作用する遺伝子としてクローニングされた。これらのことから、大腸菌two hybrid法の結果は信頼性が高いと思われる。また、MIFはホモ3量体を形成することが報告されていることから、MIF同士で相互作用を示唆している本結果は妥当であると考えられる。しかしながら、残りのクローンはフレームの合わない遺伝子や、疑陽性と思われる遺伝子であり、新たな結合因子を同定するにはいたらなかった。

今年，我们旨在使用去年克隆的MIF基因的两种混合方法来识别彼此相互作用的基因。使用MIF基因构建诱饵载体，进行DNA测序，并确认DNA序列以确保DNA序列和蛋白质框架不会脱离管线。使用该载体和由人类睾丸创建的cDNA文库同时转化了大肠杆菌。如果从该基因文库中引入的基因是与MIF基因相互作用的基因，则表达耐药性基因。这些系统用于筛选与MIF基因相互作用的基因。这些载体用于转化大肠杆菌以获得96个阳性克隆。培养这些克隆，提取DNA并进行基因测序。经过详细的分析后，有7个克隆是MIF本身。由于这7个克隆的mifcDNA的5端不在同一位置，因此它们被克隆为独立相互作用的基因。从这些原因中，据信两种混合方法的结果非常可靠。此外，由于据报道MIF形成同构二聚体，因此这表明MIF之间的相互作用被认为是合理的。但是，其余的克隆是不兼容或被认为是假阳性的基因，尚未鉴定出新的结合因子。