脂質酸化酵素リポキシゲナーゼによる魚類香気の生合成機序

脂质氧化酶脂氧合酶生物合成鱼香味的机制

• 批准号: 22K05828
• 负责人: 河邉 真也
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Fisheries Research and Education Agency
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05828/
• 关键词: リポキシゲナーゼ; cDNAクローニング; LOX; 魚臭; 短鎖オキシリピン

魚類のリポキシゲナーゼ（LOX）遺伝子の遺伝子情報を得るために、cDNAクローニングに取り組んだ。また、魚類遺伝子発現解析の基盤を構築するために、内部標準遺伝子に用いる伸長因子（EF-1α）のcDNAクローニングを試みた。海産魚類の鰓からRNAを抽出し、逆転写反応を経て一本鎖cDNAを合成した。LOX用の縮重プライマーは、哺乳類LOXの一次構造と一部の魚類ゲノム情報を基に、種を超えて保存されているアミノ酸配列を得て設計した。EF-1α用の縮重プライマーは、哺乳類から酵母まで保存されている一次構造から設計した。RT-PCR法により、ウマヅラハギとマサバの鰓から、哺乳類の12S-LOXに相同性を持つcDNA断片とEF-1αのcDNA断片を得ることに成功した。PROSITEを用いたモチーフ検索を行ったところ、魚類LOXの断片配列は、アミノ酸配列の全体にわたってLIPOXYGENASE_3（リポキシゲナーゼ鉄結合型触媒ドメイン）が認められ、LOXの酵素活性に必須な非ヘム鉄の結合に重要である3つのヒスチジン残基が保存されていることが分かった。次に転写開始点を含む完全長cDNA配列を得るために、cDNA断片配列から遺伝子特異的プライマーを設計し、5’-および3’-RACEによる完全長cDNAクローニングを試みた。転写開始点の決定には、oligo-capping法を採用した。全RNAのCIPとTAP処理とそれに続くT4 RNA ligaseによる合成オリゴの導入後、逆転写反応に供することで5’-キャップ構造を持つ完全長mRNAのみからRACE-ready cDNAを構築した。

进行cDNA克隆以获取鱼脂氧酶（LOX）基因的遗传信息。此外，为了建立鱼类基因表达分析的基础，尝试了内标基因中使用的伸长因子（EF-1α）的cDNA克隆。从海洋鱼的ill中提取RNA，并通过进行逆转录反应合成单链cDNA。通过基于哺乳动物LOX的主要结构和某些鱼类基因组信息获得跨物种的氨基酸序列，设计了LOX的退化引物。从哺乳动物到酵母的保守原代结构设计了EF-1α的退化引物。通过RT-PCR，我们成功地从马鲭鱼和鲭鱼的g中成功获得了与哺乳动物12S-lox同源的cDNA片段和EF-1αcDNA片段。使用Prosite进行了搜索，发现鱼Lox的片段是lipoxygenase_3（lipoxygogyganase Ion-Boun-Boun-Boun-Boun-Bound催化域），在整个氨基酸序列中都存在，三个组氨酸残基对于非血红素铁结合至关重要，对于lox的酶活性，必不可少。然后从cDNA片段序列设计基因特异性引物，以获得包含转录起始点的全长cDNA序列，并尝试通过5'-和3'-race克隆全长cDNA。寡核限制用于确定转录起点。在CIP和TAP处理总RNA并随后通过T4 RNA连接酶引入合成寡聚，仅通过将其进行5'-cap结构的全长mRNA构建，通过将其进行逆转录反应来构建。