免疫化学的手法を用いたアリストロキア酸の超高感度検出システムの開発

利用免疫化学方法开发马兜铃酸超灵敏检测系统

基本信息

批准号：
14780463
负责人：
田中宏幸
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、主にアリストロキア属の植物に含有される成分であるアリストロキア酸(Ari)に対するモノクローナル抗体(MAb)を作製し、本MAbを用いてアリストロキア酸の超高感度検出システムを開発することを目的としている。本申請者は、平成15年度中にAriに特異的なMAbを活用した高感度且つ迅速な免疫化学的アッセイシステムの構築を目指した。まず、スタンダードなイムノアッセイであるELISA法の確立を行った。Ari-OVA(ovalbumin)を固相化抗原とし、イムノプレート中で遊離のAriと抗Ari MAb-1A8とを競合させる競合的ELISAを検討した結果、200ng/mlから5μg/mlの濃度範囲でAri量と吸光度との間に良好な直線関係が得られた。続いて、確立した競合的ELISA法を用い、各種アリストロキア属植物に含有されるAriの分析を行った。その結果、今回確立した競合的ELISA法は、測定誤差が少なく、また高感度定量法として植物中のAriの分析に適用可能なことが明らかとなった。加えて、我々が独自に開発した新規な免疫染色法であるEastern blottingによるAriの特異的な同時検出法の構築を行った。本法は、植物エキス中の二次代謝産物をTLC板にて展開分離後、各種化合物をpolyethersulfone(PES)膜に熱転写し、膜状で抗Ari MAb-1A8を用いた免疫染色を行う。抗体の高い分子認識能を利用した本手法を用いることで、多種多様な二次代謝産物の中のAriのみが特異的に検出可能であった。また、本手法は有害作用が指摘されているAriを含有するアリストロキア属植物等の生薬、健康食品への混入を未然に防ぐ有用な評価システムとして期待できる。<参考資料>辛島誠子,田中宏幸,Waraporn Putalun,正山征洋,免疫化学的手法によるaristolochic acid高感度分析法の確立,第20回日本薬学会九州支部会講演要旨集,p.104.

在这项研究中，我们创建了一种针对马兜铃酸（Ari）的单克隆抗体（MAb），马兜铃酸是马兜铃属植物中主要含有的成分，并利用该 MAb 开发了一种超灵敏的马兜铃酸检测系统。本申请人的目标是在2003财政年度使用Ari特异性MAb构建高度灵敏且快速的免疫化学测定系统。首先，我们建立了ELISA方法，这是一种标准的免疫分析方法。使用 Ari-OVA（卵清蛋白）作为固定化抗原，我们研究了竞争性 ELISA，其中游离 Ari 与免疫板中的抗 Ari MAb-1A8 竞争，获得了数量和吸光度之间的良好线性关系。接下来，使用已建立的竞争性 ELISA 方法对各种马兜铃植物中含有的 Ari 进行分析。结果表明，新建立的竞争ELISA方法测量误差小，可作为一种高灵敏度的定量方法应用于植物中Ari的分析。此外，我们还利用自主研发的新型免疫染色方法Eastern blotting构建了Ari特异性同步检测方法。在该方法中，植物提取物中的次级代谢物在薄层色谱板上显色和分离，然后将各种化合物热转移到聚醚砜（PES）膜上，并使用抗Ari MAb-1A8对该膜进行免疫染色。该方法利用了抗体的高分子识别能力，在众多的次生代谢物中，只有Ari可以被特异性检测到。此外，该方法有望成为一种有用的评估系统，以防止马兜铃植物和其他含有马兜铃的草药和保健食品的污染，马兜铃已被证明具有有害作用。 <参考资料> 辛岛圣子、田中博之、Waraporn Putalun、庄山正宏，利用免疫化学法建立马兜铃酸的高灵敏度分析方法，第20届日本药学会九州分会摘要，p.104。