小型化抗体を活用した高性能Eastern blottingの開発研究

使用小型化抗体进行高性能Eastern blotting的研究和开发

基本信息

批准号：
17750074
负责人：
田中宏幸
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、Eastern blottingの更なる高機能化を目指し、モノクローナル抗体に代わる新規プローブの開発を行った。新規プローブとしては、抗体の可変領域をフレキシブルなペプチドリンカーで結合した小型化抗体を採用した。薬用人参の成分であるジンセノシドを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマからm-RNAを抽出した後、相補的なDNAを合成した。抗体の可変領域の遺伝子(VH, VL)を増幅するための特異的なプライマーをデザインし、各々の遺伝子を続いて増幅した。増幅した遺伝子のシークエンスを行った結果、マウスのIgGの可変領域に相当する配列を有することを確認し、その配列を基にリンカープライマーを設計した。次に、overlap extension PCRを行い、VH, VL遺伝子を連結することで小型化抗体(scFV)遺伝子を作製した。作製した抗ジンセノシドscFV遺伝子を発現用ベクターpET28(a)に導入した後、これを用いて大腸菌BL21を形質転換した。形質転換したBL21についてIPTG添加によりscFvの発現を確認した結果、分子量30kDaのタンパク質の発現を確認することができた。発現したscFvの活性を確認するために、封入体に発現したscFvの巻き戻しを行った後、ジンセノシドータンパク質コンジュゲートを固相化抗原としたELISAを行った。その結果、抗ジンノセノシドscFVはモノクローナル抗体と同等の反応性を示すことを確認した。続いて、作製した抗ジンノセノシドscFVをプローブとしてEastern blottingを行った結果、ジンセノシド類を検出することに成功した。本研究課題で日的としたメンブレンクロマトグラフィーと新規プローブを採用した高機能化Eastern blottingに世界で初めて成功した。

今年，为了进一步增强Eastern blotting的功能，我们开发了一种新的探针来替代单克隆抗体。作为一种新探针，我们采用了一种小型化抗体，其中抗体的可变区与柔性肽接头连接。从产生识别人参皂苷（药用人参成分）的单克隆抗体的杂交瘤中提取 mRNA 后，合成了互补 DNA。设计特异性引物来扩增抗体可变区基因（VH、VL），随后扩增每个基因。对扩增的基因进行测序，结果确认其具有与小鼠IgG的可变区对应的序列，并基于该序列设计了连接引物。接下来，进行重叠延伸PCR，通过连接VH和VL基因来创建小型化抗体（scFV）基因。将制备的抗人参皂苷scFV基因导入表达载体pET28(a)中，然后用于转化大肠杆菌BL21。通过添加IPTG确认转化BL21中scFv的表达，结果可以确认分子量30kDa的蛋白质的表达。为了确认表达的scFv的活性，将包涵体中表达的scFv解旋后，使用人参皂苷蛋白缀合物作为固定化抗原进行ELISA。结果证实，抗人参皂苷scFV表现出与单克隆抗体同等的反应性。随后，使用制备的抗人参皂苷scFV作为探针进行Eastern blotting，结果成功检测到人参皂苷。在这个研究项目中，我们在世界上首次成功地使用膜层析和新探针实现了高功能的东部印迹。