虚血性内耳障害における遺伝子治療の基礎的研究

缺血性内耳疾病基因治疗的基础研究

• 批准号: 14770903
• 负责人: 白馬 伸洋
• 金额: $ 3.01万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770903/
• 关键词: 虚血性内耳障害; 遺伝子治療; アデノウイルスベクター; G-DNF; ウエスタンブロット法; X-gal染色; スナネズミ; 蝸電図

本研究では一過性内耳虚血の動物モデルを用いて、正円窓経由で注入を行ったアデノウイルスの蝸牛内での発現の確認と、ウイルスベクターを介した神経栄養因子の一つであるG-DNFの投与を行い、内耳虚血後に内有毛細胞にて認められる遅発性細胞死に対する防御効果の検討を行った。1)スナネズミ蝸牛におけるアデノウイルス発現確認。スナネズミを麻酔後、正円窓経由に蝸牛内に蛍光発色蛋白質の発現を促す遺伝子を組み込んだLacZアデノウイルスベクターの注入を行った。注入4日後、蝸牛を摘出、パラホルムアルデヒドにて固定後、X-gal染色を行い、立体顕微鏡下にてウイルスの発現の観察を行った結果、蝸牛全体にウイルスの発現が認められた。またG-DNFを組み込んだアデノウイルスベクターを同様の方法にて蝸牛内に注入し、注入後の蝸牛内におけるG-DNF蛋白の測定をウエスタンプロット法にて測定を行った結果、注入7日目にてコントロールと比較し、約40倍のG-DNF蛋白の発現が認められた。2)一過性内耳虚血障害に対するG-DNFウイルスベクターによる防御効果の生理学的検討。スナネズミ蛸牛にG-DNFを組み込んだアデノウイルスベクターおよびコントロール群として外リンパ液を正円窓経由に注入し、注入4日後にスナネズミ両側椎骨動脈の血流速断・再開通により一過性内耳虚血の負荷を行った。虚血前後における動物の聴力の評価は蝿電図を測定することによって行った。結果、虚血7日目にてG-DNFアデノウイルス群がコントロール群と比較し、聴力域借上昇が有意に抑制されていた。3)一過性内耳虚血障害に対するG-DNFウイルスベクターによる防御効果の組織学的検討。虚血による内耳障害の組織学的検討についてはRhodaraine-phalloidinおよびHechst33342で採取した蝸牛の二重染色を行い、有毛細胞のF-actinと核を蛍光顕微鏡で観察し、有毛細胞の障害程度について観察をした。結果、虚血7日目にてG-DNFアデノウイルス群がコントロール群と比較し、内有毛細胞の脱落割合が有意に抑制されていた。以上の結果より、蝸牛内に投与されたアデノウイルスは蝸牛内に広く感染し、G-DNF蛋白の著明な発現を誘導すること、またアデノウイルスによって誘導されたG-DNF蛋白により、一過性虚血後の内有毛細胞における遅発性細胞死が抑制され、聴力障害が軽減されることが明らかとなり、内耳虚血障害に対する、G-DNFアデノウイルスベクターによる遺伝子治療の有効性が証明された。

在本研究中，我们使用短暂内耳缺血的动物模型来确认通过圆窗注射的腺病毒在耳蜗中的表达，并确认病毒载体介导的神经营养因子之一的表达。给药以检查其对内耳缺血后内毛细胞延迟细胞死亡的保护作用。 1) 沙鼠耳蜗中腺病毒表达的确认。沙鼠被麻醉后，将含有促进荧光蛋白表达的基因的LacZ腺病毒载体通过圆窗注射到耳蜗中。注射4天后，取出耳蜗，用多聚甲醛固定，X-gal染色，并在立体显微镜下观察病毒表达。结果，在整个耳蜗中观察到病毒表达。另外，使用相同的方法将掺入G-DNF的腺病毒载体注射到耳蜗中，并使用Western印迹法测量注射后耳蜗中的G-DNF蛋白的表达量约为G-DNF蛋白的40倍。与对照相比观察到。 2）G-DNF病毒载体对短暂性内耳缺血损伤的保护作用的生理学研究。将含有G-DNF的腺病毒载体和外淋巴液作为对照组，通过圆窗注射到沙鼠Takogyu体内，注射后4天，双侧椎骨血流快速破裂和再通，造成短暂的内耳缺血。沙鼠的动脉进行了负载。通过测量电图评估缺血前后动物的听力。结果，在缺血第7天，与对照组相比，G-DNF腺病毒组显着抑制了听力范围的增加。 3)G-DNF病毒载体对短暂性内耳缺血损伤的保护作用的组织学检查。对于缺血引起的内耳损伤的组织学检查，我们对采集的耳蜗进行罗达因-鬼笔环肽和Hechst33342双重染色，用荧光显微镜观察F-肌动蛋白和毛细胞的细胞核，并确定毛细胞损伤的程度。我做了一个观察。结果，在缺血第7天，与对照组相比，G-DNF腺病毒组的内毛细胞脱落率显着受到抑制。从以上结果我们发现，腺病毒注射入耳蜗后，广泛感染耳蜗，诱导G-DNF蛋白显着表达，并且腺病毒诱导的G-DNF蛋白暂时性地延迟了内毛细胞的细胞死亡。性缺血得到抑制，听力损失得到缓解，证明了使用G-DNF腺病毒载体进行内耳缺血性损伤的基因治疗的有效性。

项目成果

Hakuba N, Watabe K, Hyodo J et al.: "Adenovirus-mediated overexpression of a gene prevents hearing loss and progressive inner hair cell loss after transient cochlear ischemia in gerbils"Gene Therapy. 10(5). 426-433 (2003)

Hakuba N、Watabe K、Hyodo J 等人：“腺病毒介导的基因过度表达可预防沙鼠短暂性耳蜗缺血后的听力损失和进行性内毛细胞损失”基因疗法。

Koga K, Hakuba N, Watanabe F et al.: "Transient cochlear ischemia causes delayed cell death in the organ of Corti : an experimental study in gerbils."J Comp Neurol. 456(2). 105-111 (2003)

Koga K、Hakuba N、Watanabe F 等人：“短暂的耳蜗缺血导致 Corti 器官延迟细胞死亡：一项针对沙鼠的实验研究。”J Comp Neurol。

Taniguchi M, Hakuba N, Koga K et al.: "Apoptotic hair cell death after transient cochlear ischemia"Neuroreport. 20;13. 2459-2462 (2003)

Taniguchi M、Hakuba N、Koga K 等人：“短暂性耳蜗缺血后毛细胞凋亡”Neurreport。

Hakuba N, Watabe K, Hyodo 7 et al.: "Adenovirus-mediated overexpression of a gene prevents hearing loss and progressive inner hair cell loss after transient cochlear ischemia in gerbils."Gene Therapy. 10(5). 426-433 (2003)

Hakuba N、Watabe K、Hyodo 7 等人：“腺病毒介导的基因过度表达可预防沙鼠短暂性耳蜗缺血后的听力损失和进行性内毛细胞损失。”基因治疗。

白馬伸洋, 兵頭純, 谷口昌史ら: "虚血性内耳障害に対する遺伝子治療"Otol Jpn.. 12(3). 155-159 (2003)

Nobuhiro Hakuba、Jun Hyodo、Masashi Taniguchi 等：“缺血性内耳疾病的基因治疗”Otol Jpn.. 12(3) (2003)。