新規ゲノム編集タンパク質Cas12aによるB型肝炎ウイルス排除に関する検討

新型基因组编辑蛋白Cas12a消除乙型肝炎病毒的研究

基本信息

批准号：
21J13970
负责人：
塚本智仁
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J13970/
关键词：
ゲノム編集 CRISPR Cas12a 感染防御 B型肝炎ウイルス HBV アデノウイルスベクター遺伝子治療

项目摘要

CRISPR-Cas9は、ウイルスゲノムを切断することで感染を抑制可能であることから、感染症に対する新たな治療法として注目されている。B型肝炎ウイルス（HBV）によって発症するB型肝炎は、既存の薬剤でHBVゲノムを完全に排除することは極めて困難であることから、ゲノム編集によるウイルス療法の治療標的とされる。これまで、Cas9によるHBVゲノムの完全排除を目指した検討が行われてきたが、未だHBVの十分な排除には至っておらず、HBVを完全に排除可能な優れたゲノム編集ツールの開発が期待される。Cas9とは異なるゲノム編集タンパク質であるCas12aは、Cas9と同様の特異的な二本鎖DNA切断活性に加えて、塩基配列非特異的な一本鎖DNA切断活性を有する。他方でHBV粒子内のゲノムは、不完全環状二本鎖DNAであり、一本鎖DNA領域を有している。したがって、Cas12aはHBVゲノムの二本鎖DNA領域を切断すると同時に、一本鎖DNA領域を切断することにより、Cas9と比較して効率良くHBVゲノムを排除できる可能性を秘めている。そこで本研究では、HBV感染モデルにおいて、Cas12aがHBVゲノムを効率的に排除可能か検討することとした。初年度の検討で、Cas12aの核局在性を高めることにより、Cas12aのゲノム編集効率は著しく向上した。本年度は、通常の二本鎖DNA切断活性によるHBVの感染抑制効果に関する検討に着手した。まずHBV感染モデル動物への適用を見据え、HBVに対するガイドRNAおよびCas12a搭載アデノウイルスベクターの作製を行った。今後は作製したCas12a搭載アデノウイルスベクターを用い、培養細胞においてCas12aがCas9よりも強力にHBV感染を抑制可能か検討する予定である。

CRISPR-Cas9作为感染性疾病的新疗法而受到关注，因为它可以通过切割病毒基因组来抑制感染。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的，被认为是基因组编辑病毒疗法的治疗靶点，因为现有药物很难完全消除HBV基因组。迄今为止，已经开展了旨在利用Cas9彻底消除HBV基因组的研究，但尚未完全消除HBV，希望能够开发出能够彻底消除HBV Ru的优秀基因组编辑工具。 Cas12a是一种不同于Cas9的基因组编辑蛋白，具有与Cas9类似的特异性双链DNA切割活性，以及非碱基序列特异性的单链DNA切割活性。另一方面，HBV颗粒内的基因组是不完全环状的双链DNA，并且具有单链DNA区域。因此，Cas12a 通过切割 HBV 基因组的双链 DNA 区域和单链 DNA 区域，有可能比 Cas9 更有效地消除 HBV 基因组。因此，在本研究中，我们决定检查Cas12a是否可以在HBV感染模型中有效消除HBV基因组。研究第一年，通过增加Cas12a的核定位，Cas12a的基因组编辑效率显着提高。今年，我们开始研究正常双链 DNA 裂解活性对 HBV 感染的影响。首先，我们创建了 HBV 的指导 RNA 和携带 Cas12a 的腺病毒载体，着眼于应用于 HBV 感染模型动物。未来，我们计划使用所创建的配备Cas12a的腺病毒载体来研究在培养细胞中Cas12a是否比Cas9更能抑制HBV感染。