新規ゲノム編集タンパク質Cas12aによるB型肝炎ウイルス排除に関する検討

新型基因组编辑蛋白Cas12a消除乙型肝炎病毒的研究

基本信息

批准号：
21J13970
负责人：
塚本智仁
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J13970/
关键词：
ゲノム編集 CRISPR Cas12a 感染防御 B型肝炎ウイルス HBV アデノウイルスベクター遺伝子治療

项目摘要

CRISPR-Cas9は、ウイルスゲノムを切断することで感染を抑制可能であることから、感染症に対する新たな治療法として注目されている。B型肝炎ウイルス（HBV）によって発症するB型肝炎は、既存の薬剤でHBVゲノムを完全に排除することは極めて困難であることから、ゲノム編集によるウイルス療法の治療標的とされる。これまで、Cas9によるHBVゲノムの完全排除を目指した検討が行われてきたが、未だHBVの十分な排除には至っておらず、HBVを完全に排除可能な優れたゲノム編集ツールの開発が期待される。Cas9とは異なるゲノム編集タンパク質であるCas12aは、Cas9と同様の特異的な二本鎖DNA切断活性に加えて、塩基配列非特異的な一本鎖DNA切断活性を有する。他方でHBV粒子内のゲノムは、不完全環状二本鎖DNAであり、一本鎖DNA領域を有している。したがって、Cas12aはHBVゲノムの二本鎖DNA領域を切断すると同時に、一本鎖DNA領域を切断することにより、Cas9と比較して効率良くHBVゲノムを排除できる可能性を秘めている。そこで本研究では、HBV感染モデルにおいて、Cas12aがHBVゲノムを効率的に排除可能か検討することとした。初年度の検討で、Cas12aの核局在性を高めることにより、Cas12aのゲノム編集効率は著しく向上した。本年度は、通常の二本鎖DNA切断活性によるHBVの感染抑制効果に関する検討に着手した。まずHBV感染モデル動物への適用を見据え、HBVに対するガイドRNAおよびCas12a搭載アデノウイルスベクターの作製を行った。今後は作製したCas12a搭載アデノウイルスベクターを用い、培養細胞においてCas12aがCas9よりも強力にHBV感染を抑制可能か検討する予定である。

CRISPR-CAS9吸引了人们对传染病的新疗法，因为它可以通过切割病毒基因组来抑制感染。丙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的，是基因组编辑病毒疗法的治疗靶标，因为很难用现有药物完全消除HBV基因组。到目前为止，已经进行了研究以完全消除CAS9的HBV基因组，但是尚未实现足够的HBV，并且预计可以完全消除HBV的出色基因组编辑工具。 CAS12A是一种与CAS9不同的基因组编辑蛋白，具有与CAS9相似的独特双链DNA裂解活性，以及非特异性的单链DNA裂解活性，是核苷酸序列特异性的。另一方面，HBV粒子内的基因组是不完整的圆形双链DNA，并且具有单链DNA区域。因此，与CAS9相比，CAS12A具有通过裂解HBV基因组的双链DNA区域并裂解单链DNA区域来有效消除HBV基因组的潜力。因此，在这项研究中，我们决定研究CAS12A是否可以在HBV感染模型中有效消除HBV基因组。在第一年的研究中，通过增加CAS12A的核定位置，CAS12A的基因组编辑效率得到了显着提高。今年，我们开始研究正常双链DNA裂解活性对抑制HBV感染的影响。首先，为了应用于HBV感染模型动物的应用，我们准备了配备CAS12A的HBV和腺病毒载体的指导RNA。将来，我们将使用配备CAS12A的腺病毒载体，该腺病毒载体已准备好研究CAS12A是否可以比Cas9更强烈地抑制HBV感染。