音響障害における内耳グルタミン酸毒性に関する基礎的研究

声学疾病内耳谷氨酸毒性的基础研究

• 批准号: 12770973
• 负责人: 白馬 伸洋
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770973/
• 关键词: 音響外傷性難聴; グルタミン酸神経毒性; ノックアウトマウス; GLAST; 蝸電活動電位; 有毛細胞; グルタミン酸拮抗剤; アポトーシス; グルタミン酸トランスポーター; 騒音性難聴; 内有毛細胞; 微小透析法; 聴性脳幹反応; 透過型電子顕微鏡

音響外傷性難聴では巨大音の曝露や持続的騒音により、難聴は不可逆的となることが知られている。1994年、Pujolらが音響外傷性難聴をおこした動物における蝸牛の形態変化が、蝸牛に直接グルタミン酸を投与した場合と類似することを報告して以来、蝸牛の求心性神経伝達物質であるグルタミン酸による興奮性神経毒性(Exciteneurotoxity)の、音響外傷性難聴への関与が注目されている。しかし実際に音響暴露時に過剰のグルタミン酸が蝸牛内に放出され、それが神経毒性に作用しているかについては現在まで全く研究されていない。今回、遺伝子操作技術によるグルタミン酸トランスポーター欠損マウスを用いることにより、巨大音暴露後のノックアウトマウスの蝸牛外リンパ中におけるグルタミン酸動態を測定し、生理的、形態的変化を詳細に観察することにより、騒音性難聴の機序を明らかにした。申請者はH12年度、GLASTノックアウトマウスに混合ガスにより全身麻酔を施した後、8000Hz、120dBの音響負荷を60分間行い音響負荷後、急性期における蝸電活動電位測定装置を用いた聴力の変化、微小透析法を用いた蝸牛外リンパ液中のグルタミン酸濃度の測定、また電子顕微鏡を用いた蝸牛形態的変化の観察を行った結果、騒音性難聴におけるGLASTのグルタミン酸神経毒性の抑制効果について明らかにした。さらにH13年度は、毎日60分間の8000Hz、120dBの音響負荷を7〜14日間連続で行い、長期間の音響負荷による有毛細胞の変化についての研究を行った。有毛細胞の脱落数については蝸牛骨胞を摘出し、4%パラホルムアルデヒドによる蝸牛環流固定後、サーフェス・プレパレーションにて各回転のコルチ器を採取した後にロダミンパロイジンにて聴毛を染色し、ヘキスト33342にて核の二重染色を行い、蛍光顕微鏡にて脱落細胞のカウントを行う。ヘキスト33342による核の染色により、核のアポトーシス様の形態変化を起こした細胞の割合を算出し、長期音響負荷による有毛細胞障害の詳細な観察を行った。また、この時音響負荷前にグルタミン酸拮抗剤である6-7-dinitroquinoxalinc-2,3-dione (DNQX)の蝸牛内注入を行い、グルタミン酸拮抗剤による長期音響負荷による有毛細胞障害抑制効果の観察の結果、グルタミン酸拮抗剤による音響障害抑制効果も確認された。

众所周知，由于巨大的声音和可持续的噪音，听起来令人难以置信的听力损失是不可逆转的。 1994年，Pujol和其他人报告说，引起声学上的Outlawal听力损失的动物的耳蜗的形式类似于将谷氨酸直接施用到耳蜗的情况下。损失引起了人们的关注。但是，根本没有研究过在声暴露期间是否实际上将多余的谷氨酸释放到耳蜗，该谷物一直作用于神经切开术。这次，通过使用谷氨酸缺乏的小鼠与遗传操作技术，测量了巨型声音暴露后淋巴淋巴的谷氨酸动力学，并详细揭示了性听力的生理和形态变化。 。在FY12中，申请人与混合气体的混合物进行了混合物，进行了8000 Hz和120dB的声音负载60分钟，并使用声学后代更改了听力，并使用了Cochloded活性电位通过显微镜透析测量了谷氨酸淋巴中谷氨酸浓度的结果，并使用电子显微镜观察耳蜗的形态，这是噪声聋哑中的谷氨酸辛纳液的效果。在2013财年，进行了7至14天的60分钟8000 Hz和120 dB的声音负载，并研究了长期声音负载引起的毛细胞变化。关于毛细胞的头发滴数量，去除耳蜗骨细胞，并固定4％多羟基甲醛的耳蜗圆形流，并在表面收集每个旋转的皮层，并在Rodamin Paloisin染色。但是，双染色核由十六进制33342进行，并用荧光显微镜对掉落细胞进行计数。通过HEX 33342的核染色计算了引起核凋亡形态变化的细胞之比，并对长期的声音负载进行了对小节细胞疾病的详细观察。此时，在声音负担之前，将谷氨酸拮抗剂6-7-二硝基喹啉-2,3-二酮（DNQX）注射到耳蜗蝇中，并观察到配对细胞障碍的协调员由于长期的声音负荷而导致的长期声音负荷引起的辅助因子谷氨酸拮抗剂。

项目成果

N.Hakuba,K.Koga,K.Gyo,S.Usami,K.Tanaka: "Exacerbation of noise-induced hearing loss in mice lacking the glutamate transporter GLAST."The journal of Neuroscience. 20(23). 8750-8753 (2000)

N.Hakuba、K.Koga、K.Gyo、S.Usami、K.Tanaka：“缺乏谷氨酸转运蛋白 GLAST 的小鼠噪音引起的听力损失加剧。”神经科学杂志。

Hakuba N: "Exacerbation of noise-induced hearing loss in t mice lacking the glutamate transporter GNAST"Journal of Neuroscience. 20. 8750-8753 (2000)

Hakuba N：“缺乏谷氨酸转运蛋白 GNAST 的 t 小鼠中噪声引起的听力损失加剧”神经科学杂志。

白馬伸洋: "グルタミン酸トランスポーター欠損マウスにおける音響障害"Otol Jpn. 11. 103-107 (2001)

Nobuhiro Hakuba：“谷氨酸转运蛋白缺陷小鼠的声学损伤”Otol Jpn. 11. 103-107 (2001)

白馬伸洋,古賀健一郎,渡部太志,兵頭純,谷口昌史,暁清文: "グルタミン酸トランスポーター欠損マウスにおける音響障害"Otology Japan. 11-2. (2001)

Nobuhiro Hakuba、Kenichiro Koga、Futoshi Watanabe、Jun Hyodo、Masashi Taniguchi、Kiyofumi Akira：“谷氨酸转运蛋白缺陷小鼠的声学损伤”Otology Japan (2001)。