細菌由来のD-立体特異的アミノ酸アミド加水分解酵素に関する研究

细菌源D-立体特异性氨基酸酰胺水解酶的研究

基本信息

批准号：
13760076
负责人：
米田英伸
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760076/
关键词：
D-amino acid amide amidase Ochrobactrum anthropi

项目摘要

本申請者は医薬、農薬、食品等の合成原料としての利用が期待されているD-アミノ酸及びその誘導体の酵素的合成法の開発を目的として、自然界よりD-立体特異的アミノ酸アミド加水分解酵素生産菌の探索を行ってきた。細菌Ochrobactrum anthropi SV3株由来のD-アミノ酸アミダーゼはフェニルアラニンやチロシン等のアミノ酸アミドにD-立体特異的に作用する新規なアミダーゼであることを明らかにしている。本研究では、本酵素をコードする遺伝子を単離し、E.coliを宿主として本酵素の大量発現に成功し、さらに、組換え体より本酵素を精製し、酵素化学的諸性質を明らかにしている。本年度は組換え大腸菌菌体を用いた酵素法によるD-アミノ酸の合成等、応用面での用途開発を検討した。具体的にはD-アミノ酸アミダーゼ高生産組換え大腸菌の培養条件を種々検討し、、本酵素活性産生のための最適条件を設定した。次いで、最適の培養条件で大量培養して得られた菌体を用いて容易に化学合成可能なDL-フェニルアラニンアミドから医薬中間体として有用なD-フェニルアラニンを合成するための反応条件を決定した。さらに、より効率的に目的のD-アミノ酸を生産することを目的として、発現プラスミド上の本酵素遺伝子の領域にランダム変異を導入し、耐熱性が向上した酵素の作製を試みた。ランダム変異導入にはサーマルサイクラーによるerror-prone PCRの手法を用いた。変異酵素のライブラリーより、目的の性質が向上したD-アミノ酸アミダーゼを生産する大腸菌クローンを効率良く選択するためのスクリーニング手法を開発した。得られた変異酵素を組換え大腸菌より単一に精製し、酵素化学的諸性質を野生型酵素と比較した結果、耐熱性とともに触媒活性も上昇していることが明かとなった。変異プラスミドの塩基配列を決定することにより酵素の変異部位を特定し、2個のアミノ酸残基が置換されていることが判明した。そして、変異酵素組換え大腸菌の菌体を用いてDL-フェニルアラニンアミドからのD-フェニルアラニンの効率的な合成を達成した。

The applicant has been searching for bacteria that produce D-stereospecific amino acid amide hydrolase from nature, with the aim of developing enzymatic synthesis methods for D-amino acids and their derivatives, which are expected to be used as synthetic raw materials for pharmaceuticals, pesticides, foods, etc. It has been revealed that D-amino acid amidases derived from the bacterial Ochrobactrum anthropi SV3是在氨基酸酰胺（例如苯丙氨酸和酪氨酸）上作用于d-替孔的新型胺酶。在这项研究中，分离了编码该酶的基因，并使用大肠杆菌作为宿主成功地大量表达酶，并从重组中纯化酶，揭示了酶化学性质。今年，我们使用重组大肠杆菌细胞使用酶方法讨论了应用在应用中的应用，例如合成D-氨基酸。具体而言，研究了重组大肠杆菌产生的D-氨基酸氨基酶酶的各种培养条件，并设定了生产酶活性的最佳条件。接下来，使用在最佳培养条件下通过质量培养获得的细胞确定，从DL-苯丙氨酸酰胺中合成的D-苯胺中间体的合成的反应条件，可作为药物中间体，可以很容易地化学合成。此外，为了更有效地产生靶D-氨基酸，我们将随机突变引入了表达质粒的酶基因区域，并试图产生具有提高耐热性的酶。使用易于误以为的PCR方法，使用热循环仪引入随机诱变。从突变酶的库中，我们开发了一种筛选方法来有效选择具有改善靶性能的D-氨基酸氨基酶的大肠杆菌克隆。从重组大肠杆菌中以单一的方式纯化所获得的突变酶，并将酶化学性质与野生型酶进行比较，并且揭示了耐热性和催化活性的增加。通过确定突变质粒的碱基序列，鉴定了酶的位点，并发现已经取代了两个氨基酸残基。然后使用突变酶重组大肠杆菌细胞从DL-苯基丙氨酸酰胺中实现有效合成D-苯基丙氨酸。