細菌由来のD-立体特異的アミノ酸アミド加水分解酵素に関する研究

细菌源D-立体特异性氨基酸酰胺水解酶的研究

基本信息

批准号：
13760076
负责人：
米田英伸
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760076/
关键词：
D-amino acid amide amidase Ochrobactrum anthropi

项目摘要

本申請者は医薬、農薬、食品等の合成原料としての利用が期待されているD-アミノ酸及びその誘導体の酵素的合成法の開発を目的として、自然界よりD-立体特異的アミノ酸アミド加水分解酵素生産菌の探索を行ってきた。細菌Ochrobactrum anthropi SV3株由来のD-アミノ酸アミダーゼはフェニルアラニンやチロシン等のアミノ酸アミドにD-立体特異的に作用する新規なアミダーゼであることを明らかにしている。本研究では、本酵素をコードする遺伝子を単離し、E.coliを宿主として本酵素の大量発現に成功し、さらに、組換え体より本酵素を精製し、酵素化学的諸性質を明らかにしている。本年度は組換え大腸菌菌体を用いた酵素法によるD-アミノ酸の合成等、応用面での用途開発を検討した。具体的にはD-アミノ酸アミダーゼ高生産組換え大腸菌の培養条件を種々検討し、、本酵素活性産生のための最適条件を設定した。次いで、最適の培養条件で大量培養して得られた菌体を用いて容易に化学合成可能なDL-フェニルアラニンアミドから医薬中間体として有用なD-フェニルアラニンを合成するための反応条件を決定した。さらに、より効率的に目的のD-アミノ酸を生産することを目的として、発現プラスミド上の本酵素遺伝子の領域にランダム変異を導入し、耐熱性が向上した酵素の作製を試みた。ランダム変異導入にはサーマルサイクラーによるerror-prone PCRの手法を用いた。変異酵素のライブラリーより、目的の性質が向上したD-アミノ酸アミダーゼを生産する大腸菌クローンを効率良く選択するためのスクリーニング手法を開発した。得られた変異酵素を組換え大腸菌より単一に精製し、酵素化学的諸性質を野生型酵素と比較した結果、耐熱性とともに触媒活性も上昇していることが明かとなった。変異プラスミドの塩基配列を決定することにより酵素の変異部位を特定し、2個のアミノ酸残基が置換されていることが判明した。そして、変異酵素組換え大腸菌の菌体を用いてDL-フェニルアラニンアミドからのD-フェニルアラニンの効率的な合成を達成した。

本申请人开发了一种天然D-立体专一氨基酸酰胺水解酶，旨在开发D-氨基酸及其衍生物的酶法合成方法，有望作为药物、农药、食物等。我们一直在寻找产生细菌。源自人苍白杆菌 SV3 菌株的 D-氨基酸酰胺酶已被发现是一种新型酰胺酶，可对苯丙氨酸和酪氨酸等氨基酸酰胺进行 D-立体专一性作用。在本研究中，我们分离了编码该酶的基因，利用大肠杆菌作为宿主成功地大量表达了该酶，从重组体中纯化了该酶，并阐明了各种酶的化学性质。今年，我们研究了应用的开发，例如使用重组大肠杆菌细胞通过酶法合成 D-氨基酸。具体来说，我们研究了产生大量 D-氨基酸酰胺酶的重组大肠杆菌的各种培养条件，并建立了产生该酶活性的最佳条件。接下来，我们确定了从DL-苯丙氨酸酰胺合成可用作药物中间体的D-苯丙氨酸的反应条件，DL-苯丙氨酸酰胺可以使用在最佳培养条件下大量培养获得的细菌细胞轻松化学合成。此外，为了更有效地生产目标D-氨基酸，我们在表达质粒上的酶基因区域引入了随机突变，试图创造一种具有更高耐热性的酶。使用热循环仪的易错 PCR 被用来引入随机突变。我们开发了一种筛选方法，可以从突变酶文库中有效地选择产生具有改善的靶特性的 D-氨基酸酰胺酶的大肠杆菌克隆。从重组大肠杆菌中纯化所得突变酶，并将其化学性质与野生型酶进行比较，结果发现耐热性和催化活性均有所提高。通过确定突变质粒的碱基序列，我们确定了酶中的突变位点，发现两个氨基酸残基被取代。然后，我们使用突变大肠杆菌细胞实现了从 DL-苯丙氨酸酰胺高效合成 D-苯丙氨酸。