微生物のD-アミノ酸アミド加水分解酵素の機能解析と光学活性アミノ酸合成への応用

微生物D-氨基酸酰胺水解酶的功能分析及其在光学活性氨基酸合成中的应用

基本信息

批准号：
18780059
负责人：
米田英伸
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780059/
关键词：
アミダーゼ D-アミノ酸光学分割

项目摘要

D-アミノ酸は医薬品,農薬,食品添加物等の合成中間体として有用な光学活性化合物である。酵素法によるD-アミノ酸及びその誘導体の新たな合成法の開発を目的として,自然界よりD-立体選択的アミノ酸アミド加水分解酵素(D-アミノ酸アミダーゼ)生産微生物の探索を行ってきた。そこから得られたBrevibacterium iodinum由来のD-アミノ酸アミダーゼはリジン,メチオニン,グルタミン,フェニルアラニン等の様々なアミノ酸のアミドのD-体のみを厳密に認識して加水分解する新規なアミダーゼである。さらに,精製したD-アミノ酸アミダーゼの部分アミノ酸配列の情報をもとに,本酵素をコードする遺伝子をクローニングし,大腸菌での発現系を構築している。本研究ではB.iodinum由来のD-アミノ酸アミダーゼを産業的に有用なD-アミノ酸の合成触媒として応用することを目的とした。今年度は,前年度に引き続き,D-アミノ酸アミダーゼとアミノ酸アミドラセマーゼを用いたラセミ体アミノ酸アミドのダイナミックな光学分割を検討した。また,D-アミノ酸アミダーゼとアミノ酸アミドラセマーゼにランダム変異を導入し,ダイナミックな光学分割にかなう性質(安定性や基質特異性)を持った変異酵素を取得した。さらに,変異遺伝子の塩基配列を決定して,変異部位を同定し,その部位に対してその他のアミノ酸にランダム変異を導入する,いわゆるサチュレーション変異を施し,酵素の性質がさらに向上した変異酵素を取得し,D-アミノ酸合成への応用を検討した。

D-氨基酸是光学活性化合物，可作为用于药物，农药，食品添加剂等的合成中间体。为了开发通过酶学方法开发新方法来合成D-氨基酸及其衍生物，我们一直在寻找从自然中产生D-脱甲选择性氨基酸酰胺水解酶（D-氨基酸氨基酶）的微生物。从iodinum获得的D-氨基酸氨基酶酶是一种新型amidase，它严格识别和水解各种氨基酸的酰胺的D形式，例如赖氨酸，蛋氨酸，蛋氨酸，谷氨酰胺，苯丙氨酸，苯丙氨酸等。基于纯化的Dipial Acion Aid Acuse的信息，依赖于纯化的氨基酸序列的信息，克隆以在大肠杆菌中构建表达系统。这项研究旨在将B.碘的D-氨基酸氨基酶施用作为合成工业有用的D-氨基酸的催化剂。今年，在上一年之后，我们使用D-氨基酸氨基酶和氨基酸胺化酶酶研究了外消旋氨基酸酰胺的动态光学分辨率。此外，将随机突变引入D-氨基酸氨基酶和氨基酸胺化酶，以获得具有动态光学分辨率（稳定和底物特异性）的特性的突变酶。此外，确定突变基因的基本序列，确定突变位点，并通过执行所谓的饱和突变来执行突变位点，其中将随机突变引入该位点的其他氨基酸，并获得了具有改善性能的突变酶，并将其应用于D-Daminoin Acidy的应用。