微生物のD-アミノ酸アミド加水分解酵素の機能解析と光学活性アミノ酸合成への応用

微生物D-氨基酸酰胺水解酶的功能分析及其在光学活性氨基酸合成中的应用

基本信息

批准号：
18780059
负责人：
米田英伸
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780059/
关键词：
アミダーゼ D-アミノ酸光学分割

项目摘要

D-アミノ酸は医薬品,農薬,食品添加物等の合成中間体として有用な光学活性化合物である。酵素法によるD-アミノ酸及びその誘導体の新たな合成法の開発を目的として,自然界よりD-立体選択的アミノ酸アミド加水分解酵素(D-アミノ酸アミダーゼ)生産微生物の探索を行ってきた。そこから得られたBrevibacterium iodinum由来のD-アミノ酸アミダーゼはリジン,メチオニン,グルタミン,フェニルアラニン等の様々なアミノ酸のアミドのD-体のみを厳密に認識して加水分解する新規なアミダーゼである。さらに,精製したD-アミノ酸アミダーゼの部分アミノ酸配列の情報をもとに,本酵素をコードする遺伝子をクローニングし,大腸菌での発現系を構築している。本研究ではB.iodinum由来のD-アミノ酸アミダーゼを産業的に有用なD-アミノ酸の合成触媒として応用することを目的とした。今年度は,前年度に引き続き,D-アミノ酸アミダーゼとアミノ酸アミドラセマーゼを用いたラセミ体アミノ酸アミドのダイナミックな光学分割を検討した。また,D-アミノ酸アミダーゼとアミノ酸アミドラセマーゼにランダム変異を導入し,ダイナミックな光学分割にかなう性質(安定性や基質特異性)を持った変異酵素を取得した。さらに,変異遺伝子の塩基配列を決定して,変異部位を同定し,その部位に対してその他のアミノ酸にランダム変異を導入する,いわゆるサチュレーション変異を施し,酵素の性質がさらに向上した変異酵素を取得し,D-アミノ酸合成への応用を検討した。

D-氨基酸是光学活性化合物，可用作药物、农业化学品、食品添加剂等的合成中间体。为了开发一种酶法合成D-氨基酸及其衍生物的新方法，我们一直在自然界中寻找产生D-立体选择性氨基酸酰胺水解酶（D-氨基酸酰胺酶）的微生物。源自碘短杆菌的D-氨基酸酰胺酶是一种新型酰胺酶，它仅严格识别并水解赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等各种氨基酸的D-氨基酸。此外，根据纯化的D-氨基酸酰胺酶的部分氨基酸序列信息，我们克隆了编码该酶的基因，并构建了大肠杆菌中的表达系统。本研究的目的是应用源自 B.iodinum 的 D-氨基酸酰胺酶作为催化剂来合成工业上有用的 D-氨基酸。今年，继去年之后，我们研究了使用D-氨基酸酰胺酶和氨基酸酰胺消旋酶对外消旋氨基酸酰胺的动态光学拆分。我们还在D-氨基酸酰胺酶和氨基酸酰胺消旋酶中引入了随机突变，获得了具有适合动态光学分辨率的特性（稳定性和底物特异性）的突变酶。此外，我们确定突变基因的核苷酸序列，识别突变位点，并进行所谓的饱和突变，即在该位点的其他氨基酸中引入随机突变，以获得酶性质进一步改善的突变酶。然后我们研究了其在 D-氨基酸合成中的应用。