細菌由来のポリヒドロキシ酪酸分解酵素に関する研究

细菌源聚羟基丁酸酯降解酶的研究

• 批准号: 09760098
• 负责人: 米田 英伸
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Toyama Prefectural University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760098/
• 关键词: ポリヒドロキシ酪酸; PHBデポリメラーゼ; Arthrobacter; 遺伝子; クローニング; 酵素精製

近年プラスチック廃棄物による環境汚染が問題となるに至り、自然環境下で分解するポリヒドロキシ酪酸(PHB)等の生分解性プラスチックの開発が進められている。生分解性プラスチックの開発において必要不可欠である分解性試験のための試薬として有用であるPHBデポリメラーゼの大量生産、本酵素産生微生物の自然界における分布の検討、産生微生物間における本酵素の酵素化学的な相違点の検討、及び本酵素の一次構造解析による分子進化論的な考察を目的として本酵素を産生する微生物を広く自然界よりスクリーニングした。富山県下の土壌及び活性汚泥からのスクリーニングにより得られたPHB分解菌Arthrobactersp W6株はPHBデポリメラーゼを菌体外に分泌する。培養上清中の酵素活性が最大となる条件で本菌を培養し、得られた培養上清よりPHBデポリメラーゼを均一に精製した。この精製した酵素の至適温度・pH、安定温度・pH、阻害剤、基質特異性、補酵素の要求性、及び速度論的解析等の各種酵素化学的諸性質を検討し、他の微生物由来のポリヒドロキシ酪酸加水分解酵素と比較した。本年度においては、新たに本菌からゲノミックDNAを抽出し、適当な制限酵素で断片化した後、プラスミドに挿入してゲノミックDNAライブラリーを作製した。これよりPHBデポリメラーゼをコードする遺伝子を含むクローンをPHBを含む不透明なプレート上に現れるクリアーゾーンを指標としてPHBデポリメラーゼ活性を有する形質転換大腸菌を選抜した。得られた遺伝子の塩基配列を決定し、そこから推定される本酵素の一次構造を他の微生物由来のポリヒドロキシ酪酸加水分解酵素と比較した。さらに、得られたPHBデポリメラーゼ遺伝子を用いて大腸菌での大量発現系の構築を試みた。

近年来，塑料废物引起的环境污染已成为一个问题，并且已经开发了在自然环境中分解的可生物降解塑料（例如多羟基酸（PHB））。大量生产PHB去叶聚体，可作为分解测试的试剂，这对于可生物降解塑料的发展是必不可少的，目的是研究差异的差异和分子进化考虑该酶的主要结构分析的目的与自然世界广泛筛选。通过筛查富马县的土壤和活性污泥获得的PHB破裂细菌ARMTHOBACTERP W6菌株分泌细菌外的PHB去糖化酶。细菌是在培养培养中最大酶活性下培养的，PHB去糖化酶从获得的培养物中均匀地纯化。检查各种酶化学性质，例如最佳温度 / pH，pH，抑制性，底物特异性，保守性的要求以及对这种纯化酶的基于速度的分析。在这个财政年度，从细菌中新提取基因组DNA，并用适当的受限酶碎片，并在质粒中产生了基因组DNA文库。这是从包含一个基因的克隆中选择的，该基因编码了在不清楚的板上出现的透明区域上，该透明区域中包含PHB作为指数。确定所获得的基因的碱基序列，并将该酶的主要结构与其他微生物衍生的多羟基酸水解进行比较。此外，我们尝试使用所获得的PHB去糖化酶基因来建立一个大肠杆菌的大型系统。

项目成果

Michihiko Kobayashi: "Characterization and distribution of IS1164 that exists in the high molecular mass nitrile hydratase gene cluster of the industrial microbe Rhodococcus rhodochrous J1" Proceedings of the Japan Academy. 73(6). 104-108 (1997)

Michihiko Kobayashi：“工业微生物红球菌 J1 的高分子质量腈水合酶基因簇中存在的 IS1164 的特征和分布”日本科学院院刊。

Hidenobu Komeda: "A novel transporter involved in cobalt uptake." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 94. 36-41 (1997)

Hienobu Komeda：“一种参与钴吸收的新型转运蛋白。”